發(fā)布時間：2018-04-16 19:11

  本文選題：漢坦病毒 + M基因��； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 漢坦病毒(Hantavirus,HV)屬于世界范圍內(nèi)分布的、尚不能控制的對人類有致死性威脅疾病的病原體之一,可以引起腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(Hantavirus pulmonary syndrome,HPS)。HFRS是一種全球性的急性傳染病,疫區(qū)分布廣泛、發(fā)病機制復(fù)雜、病情危重易變,并發(fā)癥多而難治,病死率居高不下,嚴(yán)重危害人類的生命健康。我國是世界上受HFRS危害最重的國家,HFRS發(fā)病人數(shù)占世界總發(fā)病人數(shù)的90%以上,在我國是除病毒性肝炎之外危害最大的病毒性傳染病,每年約發(fā)生5萬～10萬例,疫情仍得不到有效控制。目前尚無特效治療藥物�！邦A(yù)防為主”是控制傳染病的基本原則,因此研制安全、有效的疫苗是控制本病流行和發(fā)生的關(guān)鍵。 HV屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬,由核衣殼和囊膜組成,其核酸類型為單負(fù)鏈RNA,分為小(S)、中(M)和大(L)三個基因片段,分別編碼病毒的核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,NP)、囊膜糖蛋白(glycoprotein,GP)G1和G2以及RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RDRP)。研究表明,HV的囊膜糖蛋白GP及核蛋白NP均與其保護性免疫有關(guān)。一般認(rèn)為GP主要誘發(fā)保護性體液免疫應(yīng)答,其可刺激機體產(chǎn)生中和抗體,對感染動物和人體均具有保護作用。GP上具有病毒毒力位點、中和抗原及型特異性抗原位點等多種抗原決定簇,還具有血凝活性位點,是重要的保護性抗原。但GP的免疫原性較弱,刺激機體產(chǎn)生的抗體出現(xiàn)晚,滴度不高。而核蛋白NP是HV另一重要的結(jié)構(gòu)蛋白,其在宿主體內(nèi)的表達量最高,有很強的抗原性和免疫原性,其刺激機體產(chǎn)生的特異性抗體出現(xiàn)早、滴度高、維持時間長。國內(nèi)外研究結(jié)果證實NP具有B細(xì)胞和T細(xì)胞決定簇,可誘導(dǎo)機體同時產(chǎn)生保護性體液免疫和細(xì)胞免疫。本室前期研究表明,NP上也存在中和抗原位點,并且抗原位點大多位于S基因5′端約0.7kb片段編碼的蛋白上。 本實驗采用HV國際標(biāo)準(zhǔn)株——漢灘病毒76-118株,將其M基因G1片段和S基因5′端約0.7 kb片段進行了融合表達,以期達到不同結(jié)構(gòu)蛋白在刺激機體免疫應(yīng)答中的優(yōu)勢互補。我們利用本室前期構(gòu)建并經(jīng)測序的重組質(zhì)粒pShuttle-G1S0.7,經(jīng)雙酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表達載體pVAX1,得到重組質(zhì)粒pVAX-G1S0.7,再以脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人胚腎(HEK)293細(xì)胞,并采用ELISA和Western-blot對表達產(chǎn)物進行鑒定。ELISA檢測結(jié)果和Western-blot結(jié)果顯示,漢坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293細(xì)胞中得到了表達,所表達的融合蛋白分子量約90kD,與預(yù)期大小一致,并且表達產(chǎn)物可與抗?jié)h坦病毒NP mAb特異性結(jié)合。 在此基礎(chǔ)上,我們對該重組質(zhì)粒的基因免疫效果進行了初步研究。采用基因槍免疫途徑,將上述重組質(zhì)粒DNA包被于金顆粒上制成基因槍子彈轟擊C57小鼠腹部皮膚進行接種。每隔兩周免疫一次,共免疫四次。用ELISA法和ELISpot法分別檢測免疫鼠的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答效果。對各組小鼠不同免疫時間血清中特異性抗體的ELISA檢測結(jié)果表明,重組質(zhì)粒經(jīng)基因槍免疫后可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗?jié)h坦病毒GP的抗體,但抗體出現(xiàn)晚,滴度低。ELISpot試驗檢測免疫鼠脾臟中特異性分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞(SFC,spot forming cells)數(shù)目,結(jié)果表明,重組質(zhì)粒刺激小鼠產(chǎn)生的SFC數(shù)量明顯高于空載體對照組及空白對照組,說明其可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。 以上實驗結(jié)果表明,構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過基因槍接種方式,不僅可刺激機體產(chǎn)生特異性的低滴度的體液免疫應(yīng)答,還可刺激機體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答,不足之處在于基因槍免疫途徑未能顯著提高免疫小鼠的體液應(yīng)答水平。在以后的研究中,需要進一步摸索基因槍技術(shù)使用的最佳條件,還需在載體選擇、注射時間、注射劑量等方面作更深入的研究,進一步探索如何提高基因免疫的效應(yīng),為研制出漢坦病毒基因疫苗奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Hantaviruses ( HV ) belong to one of the pathogen of worldwide distribution , which is not yet controlled by lethal threat to humans , and can cause hemorrhagic fever with renal syndrome , hemorrhagic fever with renal syndrome and Hantan pulmonary syndrome . Hemorrhagic Fever is a global acute infectious disease , the epidemic area is widespread , the pathogenesis is complex , the disease is critical , the complications are many , the morbidity is high , the mortality rate is high , serious harm to the human life health . China is the world of the most dangerous virus infectious disease , the epidemic is still not effectively controlled . At present , there is no special effect treatment medicine . " Prevention is the main " is the basic principle of controlling infectious diseases , so the development of safe and effective vaccine is the key to control the epidemic and the occurrence of this disease .


HV belongs to the genus Hantaviruses of Virginia , consisting of a nuclear capsid and a capsule . The nucleic acid type is single negative strand RNA . It is divided into three gene segments of small ( S ) , medium ( M ) and large ( L ) , respectively , encoding the virus ' s nuclear capsid protein ( NP ) , glycoprotein ( GP ) G1 and G2 , and RNA polymerase ( RNA dependent RNA polymerase , Rdrp ) . The results of this study show that the NP is a major structural protein , which has the highest expression level in the host , and has high antigenicity and immunogenicity . The results of the study show that NP has the highest expression level in host , and has high antigenicity and immunogenicity .


The recombinant plasmid pShuttle - G1S0.7 was constructed and sequenced . The recombinant plasmid pShuttle - G1S0.7 was cloned into eukaryotic expression vector pShuttle - G1S0.7 . The recombinant plasmid pShuttle - G1S0.7 was cloned into eukaryotic expression vector pShuttle - G1S0.7 . The recombinant plasmid pShuttle - G1S0.7 was cloned into eukaryotic expression vector pShuttle - G1S0.7 . The recombinant plasmid pShuttle - G1S0.7 was cloned into eukaryotic expression vector pShuttle - G1S0.7 . The molecular weight of the expressed fusion protein was about 90kD , which was consistent with the expected size , and the expression product could be specifically bound to the anti - Hantanvirus NP mAb .


On the basis of this , we have carried out a preliminary study on the gene immunization effect of the recombinant plasmid . The recombinant plasmid DNA was coated on the gold particles by gene gun immunization . The humoral immune responses and cellular immune responses of the immunized mice were detected by ELISA . The results showed that the number of specific antibodies produced by the recombinant plasmid was higher than that of the empty vector control group and the blank control group . The results showed that the recombinant plasmid could induce the specific cellular immune response .


The results show that the recombinant plasmid constructed can not only stimulate the body fluid immune response with low titer , but also stimulate the organism to produce specific cellular immune response , and the deficiency is that the immune pathway of gene gun does not significantly improve the humoral response level of immune mice . In the future research , it is necessary to further study the optimal conditions for the use of gene gun technology , and further explore how to improve the effect of gene immunization and lay the foundation for the development of the Hantaviruses gene vaccine .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 丁紅旗;;老年腎綜合征出血熱214例臨床特點分析[J];內(nèi)蒙古中醫(yī)藥;2010年15期

2 程林峰;白露;李凱;李璞媛;胡剛;于瀾;吳興安;徐志凱;張芳琳;;漢坦病毒感染C57BL/6小鼠組織中特異性抗原的檢測[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2011年05期

3 丁魯民;;上�？诎秳游锼拗鲾y帶漢坦病毒及其體表寄生蟲監(jiān)測[J];中國媒介生物學(xué)及控制雜志;2011年04期

4 李明慧;陳小萍;楊國慶;沈鐵峰;劉保;郭文平;張永振;;葫蘆島市居民區(qū)褐家鼠攜帶的漢坦病毒分析[J];中國媒介生物學(xué)及控制雜志;2011年03期

5 程茂玲;喬剛;;青島地區(qū)腎綜合征出血熱病毒基因分型[J];檢驗醫(yī)學(xué);2011年08期

6 鄒默;鄧璐;張赫男;羅恩杰;;腎綜合征出血熱發(fā)病機制的研究現(xiàn)狀[J];醫(yī)學(xué)綜述;2011年17期

7 李臘梅;馬小絨;;口腔灌洗在重癥腎綜合征出血熱護理中的應(yīng)用[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2011年24期

8 漆少廷;韓建平;;某國元首專機發(fā)現(xiàn)死鼠處置情況的報告[J];旅行醫(yī)學(xué)科學(xué);2011年01期

9 麥肖興;;流行性出血熱急性腎衰患者血液透析的護理[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2011年18期

10 董金永;徐偉;張洪蓮;;中西醫(yī)結(jié)合治療流行性出血熱并發(fā)竇性心動過緩[J];中國民間療法;2011年09期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張永振;姚來順;扈光偉;王洪霞;杜占森;李明慧;;吉林大林姬鼠中漢坦病毒的遺傳分析[A];全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

2 鄢燕貞;張永振;姚來順;扈光偉;李明慧;杜占森;陳化新;;吉林省褐家鼠中漢坦病毒的分型研究[A];全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

3 鄧遠(yuǎn)玲;陳文青;孫小康;詹巧莉;駱俊儒;;清遠(yuǎn)市鼠形動物自然感染漢坦病毒調(diào)查[A];新發(fā)和再發(fā)傳染病防治熱點研討會論文集[C];2011年

4 賈繼輝;于修平;王勇;卞繼峰;趙蔚明;周亞濱;欒怡;齊眉;楊海寧;張茂修;;漢坦病毒基因分型方法的建立及應(yīng)用[A];山東免疫學(xué)會、山東微生物學(xué)會醫(yī)學(xué)微生物學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)學(xué)會微生物學(xué)和免疫學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)藥生物技術(shù)學(xué)會2001年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2001年

5 賈繼輝;于修平;王勇;卞繼峰;趙蔚明;周亞濱;欒怡;齊眉;楊海寧;張茂修;;山東地區(qū)漢坦病毒重要基因序列進化關(guān)系樹的構(gòu)建[A];山東免疫學(xué)會、山東微生物學(xué)會醫(yī)學(xué)微生物學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)學(xué)會微生物學(xué)和免疫學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)藥生物技術(shù)學(xué)會2001年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2001年

6 屈勇剛;剡根強;張永振;張再清;;北方部分地區(qū)漢坦病毒的分離與鑒定[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

7 鄒洋;張永振;張海林;李明慧;陳化新;;云南省褐家鼠中漢坦病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查[A];全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

8 李瑩;張永振;肖奇友;李明慧;陳化新;;湖南省嚙齒動物中漢坦病毒的流行病學(xué)研究[A];全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

9 白文濤;徐志凱;張芳琳;羅雯;劉勇;吳興安;閻巖;;抗?jié)h坦病毒NP抗原細(xì)胞內(nèi)抗體的瞬時表達及活性檢測[A];第6次全國微生物學(xué)與免疫學(xué)大會論文摘要匯編[C];2004年

10 王濤;李建東;劉峰;梁米芳;;抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體抗病毒作用的研究[A];第七次全國腎綜合征出血熱學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 鄭靈巧;我國找到一種新型漢坦病毒[N];健康報;2008年

2 記者 白毅;我國學(xué)者合成抗?jié)h坦病毒的化合物[N];中國醫(yī)藥報;2009年

3 鄭靈巧;出血熱防控面臨普馬拉型漢坦病毒挑戰(zhàn)[N];健康報;2007年

4 鄭靈巧;出血熱防控面臨新病毒挑戰(zhàn)[N];大眾衛(wèi)生報;2007年

5 鄭靈巧;漢坦病毒出現(xiàn)基因重排[N];健康報;2008年

6 鄭靈巧;我國發(fā)現(xiàn)兩個新型漢坦病毒[N];健康報;2008年

7 朱立明;四軍醫(yī)大HFRS研究取得系列成果[N];中國醫(yī)藥報;2006年

8 記者 段佳;我國學(xué)者找到呼吸道病毒新克星[N];大眾科技報;2009年

9 杜恒輝 朱立明;流行性出血熱發(fā)病1～3天可診斷[N];健康報;2006年

10 記者 鄭靈巧;我國首次發(fā)現(xiàn)棕背■攜帶北海道病毒[N];健康報;2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 鄧海英;鹽酸阿比朵爾抗?jié)h坦病毒作用研究[D];武漢大學(xué);2009年

2 劉婧;湖北地區(qū)漢坦病毒與宿主的基因進化研究[D];武漢大學(xué);2011年

3 張永國;禽流感及漢坦病毒反向遺傳操作體系建立[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

4 史俊巖;腎綜合征出血熱免疫診斷技術(shù)及其應(yīng)用研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

5 李璞媛;漢坦病毒嵌合基因G1S0.7、G2S0.7重組腺病毒的改建、表達及其免疫學(xué)特性的比較研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

6 康文臻;漢坦病毒基因重排的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

7 劉合賓;漢坦病毒疫苗株Z10（HINV）與Z37（SEOV）核蛋白表達及生物學(xué)功能研究[D];浙江大學(xué);2004年

8 鄭蘭艷;漢坦病毒核酸疫苗的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

9 徐芳玲;漢坦病毒對人胚肺成纖維細(xì)胞基因表達及細(xì)胞凋亡的影響[D];武漢大學(xué);2004年

10 羅雯;漢坦病毒囊膜糖蛋白G1與核蛋白部分片段在昆蟲細(xì)胞中的融合表達及免疫學(xué)特性研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 楚琰;漢坦病毒G1S0.7嵌合基因的真核表達及其經(jīng)基因槍免疫的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

2 曹智偉;中國部分地區(qū)漢坦病毒在鼠形動物中感染及基因變異[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

3 白露;纖維連接蛋白在漢坦病毒感染致病中作用的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

4 衛(wèi)蘭;應(yīng)用生態(tài)位模型預(yù)測漢坦病毒和禽流感病毒感染風(fēng)險分布[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

5 楊棟強;漢坦病毒β3整合素受體拮抗劑的篩選及其特性的初步鑒定[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

6 王玉;腎綜合征出血熱疫源地漢坦病毒的分子流行病學(xué)研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

7 李震海;青島市郊2001～2003年漢坦病毒分離株M區(qū)基因序列測定與分析[D];青島大學(xué);2004年

8 白文濤;抗?jié)h坦病毒單克隆抗體1A8鼠/人嵌合Fab抗體表達載體的構(gòu)建及鑒定[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

9 張明香;腎綜合征出血熱病毒S基因克隆、表達及其應(yīng)用研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2003年

10 劉京梅;漢坦病毒重組核衣殼蛋白為抗原的ELISA的建立及其血清分型研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

，

本文編號：1760227