發(fā)布時(shí)間：2018-04-16 08:12

  本文選題：登革病毒 + 表位��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 研究背景與目的 登革病毒(Dengue virus, DEN)為黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)成員,含4個(gè)血清型(DEN-1、-2、-3和-4)。登革病毒為單股正鏈RNA病毒,共11kb,其基因組可分為兩部分：5'端1／4的序列編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白；3'端3／4的序列編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白,編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的基因順序?yàn)椋?'UTR-C-prM(M)-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-UTR3'。 登革病毒的感染已成為世界性衛(wèi)生問(wèn)題。登革病毒感染可引起登革熱(Dengue fever, DF),登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever, DHF)以及登革休克綜合征(Dengue shock syndrome, DSS),主要流行于熱帶與亞熱帶地區(qū),每年約新增5億感染病例,全球25億人正面臨著登革病毒的感染。它的傳播媒介主要是埃及伊蚊和白紋伊蚊,目前,登革的預(yù)防主要通過(guò)切斷蚊媒傳播,尚無(wú)有效的疫苗用于預(yù)防。 現(xiàn)今登革疫苗研究較有成效的有減毒活疫苗,嵌合病毒疫苗,重組亞單位疫苗,DNA疫苗等,但都存在安全性差,有效性不高的問(wèn)題。研制登革疫苗困難的原因主要有：(1)登革病毒的致病機(jī)理尚不明確；(2)尚無(wú)合適的動(dòng)物模型模擬DHF/DSS的發(fā)病過(guò)程；(3)研制的疫苗需對(duì)四個(gè)血清型的DEN感染均有保護(hù)作用,增加了疫苗研制的難度；(4)研制周期長(zhǎng),潛在的副作用限制等。 現(xiàn)今,新型的多表位肽疫苗成為登革疫苗研究的新方向。自20世紀(jì)80年代Strohmaier等人發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒的146-154及200-213位氨基酸序列含有抗原性位點(diǎn),從而找到了一種新型的疫苗,即表位疫苗。多表位肽疫苗具有安全性好、高度特異性、易保存和使用方便等優(yōu)點(diǎn)。隨著分子免疫學(xué),分子生物學(xué)和生物工程信息學(xué)的發(fā)展,為病毒尋找抗原性表位提供了捷徑。近年來(lái)表位肽疫苗已成為疫苗研究的熱點(diǎn)。在抗病毒表位肽疫苗的研究中,現(xiàn)有HIV (Human immunodeficiency virus)、HCV(Hepatitis C virus)和HPV(Human papillomavirus)等多表位肽疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。 理想的多表位肽疫苗需免疫原性強(qiáng),能誘導(dǎo)機(jī)體既產(chǎn)生體液免疫又產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。登革病毒的E蛋白(envelope glycoprotein)是公認(rèn)的可引起機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的重要抗原蛋白,其含有可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原決定簇。E蛋白為糖蛋白,位于病毒表位構(gòu)成病毒顆粒表面的突起,以同源二聚體的形式存在,它介導(dǎo)病毒和細(xì)胞受體的結(jié)合,使病毒進(jìn)入細(xì)胞,發(fā)生感染。E蛋白單體可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域(Domain):DⅠ、DⅡ和DⅢ�？笵Ⅱ和DⅢ的抗體都可以表現(xiàn)出中和病毒的作用,但抗DⅢ的抗體表現(xiàn)出極強(qiáng)的中和病毒作用,病毒型特異性更強(qiáng)。 本研究以DEN-2 NGC株E蛋白的DⅢ為研究對(duì)象,應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù),通過(guò)網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)軟件和DNAstar等軟件對(duì)E蛋白和E蛋白的B、T細(xì)胞表位分析,認(rèn)為DⅢ免疫原性強(qiáng)和特異性好,其中RHVLGRLITVNPIVT E345～359和EPGQLKLNWFKKGSS E383～397序列最有可能為T(mén)和B細(xì)胞表位。 在亞單位疫苗的研究中,Consogno等在設(shè)計(jì)腫瘤多表位肽疫苗的研究中,預(yù)測(cè)雜合性T細(xì)胞表位,Th表位預(yù)測(cè)的一項(xiàng)重要成果是泛DR表位(pan-DR epitope, PADRE),它是一含13個(gè)氨基酸殘基的人造通用型Th細(xì)胞表位,序列為AKFVAAWTLKAAA等。實(shí)驗(yàn)證明將PADRE與T表位或B細(xì)胞表位串聯(lián)構(gòu)建的多表位肽疫苗可以誘導(dǎo)高效的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答,而且還發(fā)現(xiàn)PADRE對(duì)人體安全,無(wú)毒副作用。 本研究將初步驗(yàn)證的登革病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的T細(xì)胞表位(RHVLGRLITVNPIVT E345～359)和B細(xì)胞表位(EPGQLKLNWFKKGSS E383～397)連同PADRE串聯(lián)成線(xiàn)性多表位肽結(jié)構(gòu),中間間隔GG氨基酸序列,用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)多表位肽進(jìn)行分析,合成P1 (AKFVAAWTLKAAAGGRHVLGRLITVNPIVT GGEPGQLNWFKKGSS,純度96.5%)線(xiàn)性多表位肽。同時(shí)合成一同行對(duì)照肽P2 (AKFVAAWTLKAAAGGKKSKAINVLGGIGESHFK GLVLI,純度76.7%),其中P2序列中除PADRE序列與P1相同外,其他氨基酸序列為隨意序列。將線(xiàn)性表位肽免疫C57BL／6j小鼠,觀察其誘導(dǎo)體液、細(xì)胞免疫應(yīng)答和保護(hù)性效應(yīng)。 研究方法 1、多表位肽的生物信息學(xué)分析 運(yùn)用在線(xiàn)的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器http://www. expasy. org/cgi-bin/protparam分析多表位肽P1的分子量、等電點(diǎn)和穩(wěn)定性分析等情況。運(yùn)用DNAstar軟件分析多表位肽P1的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和免疫原性所在區(qū)段。使用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov的網(wǎng)絡(luò)BLAST分析,觀察多表位肽氨基酸序列的病毒型特異性。采用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器預(yù)測(cè)多表位肽有無(wú)信號(hào)肽,及對(duì)信號(hào)肽切割位點(diǎn)進(jìn)行分析。 2、線(xiàn)性表位肽誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答 SPF級(jí)4-6周齡雌性C57BL/6j小鼠共30只,隨機(jī)分為P1組、P2組和PBS陰性對(duì)照組,每組共10只。每組相應(yīng)免疫P1和P2,量100μg/只100μL, PBS陰性對(duì)照組免疫PBS緩沖液100μL,各免疫原與等體積的弗氏佐劑乳化后,腹部皮下多點(diǎn)注射,免疫三次,每次免疫間隔兩周。分別于免疫前,免疫后第1、2和3次后兩周(即免疫后2、4和6周)剪鼠尾采血,待其凝固后離心取血清,加入等量甘油凍純于-20℃。經(jīng)間接ELISA檢測(cè)不同組別的小鼠于免疫后第2、4和6周的抗體滴度。每組隨機(jī)抽取7份免疫血清標(biāo)本,在2倍稀釋梯度下測(cè)OD450nm吸光度A值,以免疫前小鼠血清作陰性對(duì)照組。以待測(cè)標(biāo)本Dλ值／陰性對(duì)照Dλ值2.1為陽(yáng)性,出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度作為該標(biāo)本的滴度。 用100TCID50 DEN-2 NGC感染將24孔板內(nèi)Vero細(xì)胞,96小時(shí)后固定透化,Ⅲ分別加入不同免疫組別的多抗血清(P1、P2和PBS免疫后多抗血清、免疫前血清和兔抗登革病毒多抗血清)孵育過(guò)夜,洗滌后加入FITC-抗小鼠IgG或抗兔IgG,37℃孵育20min后洗滌,熒光顯微鏡下觀察。 同前法免疫小鼠,于末次免疫后兩周分離小鼠脾淋巴細(xì)胞,以2.5×106個(gè)／mL的細(xì)胞溶度種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,分別加入不同刺激原P1和P2各為25μg/mL,半適量PHA 5μg/mL, PBS 5μL/mL,完全培養(yǎng)基陰性對(duì)照組,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。孵育48小時(shí)后,加入CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)后測(cè)OD450nm吸光度A值,以公式：刺激指數(shù)=(樣本孔吸光值-空白孔吸光值)／(陰性對(duì)照孔吸光值-空白孔吸光值)×100%為準(zhǔn),計(jì)算刺激指數(shù)。 按前法將小鼠免疫P1后,分離小鼠脾淋巴細(xì)胞種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入不同的刺激原(P1和P2各25μg/mL, PBS5μL/mL,重復(fù)例數(shù)為4),孵育6小時(shí)后,按細(xì)胞因子染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法對(duì)脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)因子染色,后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 3、線(xiàn)性表位肽的保護(hù)性研究 小鼠共20只,免疫法同前,分為P1、P2和PBS免疫組及空白組,每組共5只,腹腔注射感染DEN-2 NGC株2×109copies/只100μL,于感染后第1、3和5天剪鼠尾采血150μL, Trizol法提取全血總RNA,逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA后,用絕對(duì)定量Real-time PCR法測(cè)定病毒載量。 隨機(jī)抽取不同免疫組別(P1、P2和PBS免疫組)末次免疫多抗血清3份,做2倍稀釋梯度,從1：2至1：128,同時(shí)用完全培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組。將100 TCID50病毒懸液與不同稀釋度的實(shí)驗(yàn)血清等體積混合,37℃水浴孵育1小時(shí)后感染已鋪種Vero細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)。孵育后棄病毒上清液,加入含4%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于5%CO237℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。每日顯微鏡下觀察細(xì)胞病變,共觀察7天,能抑制病變的50%的血清稀釋度即為陽(yáng)性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、將PADRE和已分析得到的登革病毒特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞表位串聯(lián),再次用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)和DNAstar軟件對(duì)其進(jìn)行分析,該表位肽分子量較大(MW=4474.28),半衰期長(zhǎng)(T50=4.4h),等電點(diǎn)為11.17。并且通過(guò)抗原性、特異性和信號(hào)肽分析,此表位肽具有免疫原性、型特異性和信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。 2、線(xiàn)性表位肽P1免疫小鼠后,可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)的體液免疫反應(yīng),于免疫后第2、4和6周的抗體滴度為200±141.42,25600±18101,95085±19351,而P2對(duì)照組分別為8.57±3.78,62±46,814±589；PBS免疫小鼠后不能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。經(jīng)SPSS13.0重復(fù)測(cè)量方差分析(ANOVA for the repested measures)結(jié)果表明,不同組間IgG水平有顯著的差異(F=109.75,P0.001)；不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的IgG水平有顯著差異(F=86.75,P0.001)；組別同時(shí)間之間有交互作用(不同組隨時(shí)間變化,IgG變化不同,F=83.69,P0.001)。以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-samples T test)對(duì)各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行組間分析,免疫后2、4和6周,組間均有顯著差異(P0.05)。 不僅如此,抗P1多抗血清可與感染DEN-2 NGC株的Vero細(xì)胞內(nèi)的登革病毒結(jié)合,經(jīng)FITC-抗小鼠IgG染色后,熒光顯微鏡下觀察在Vero細(xì)胞漿內(nèi)和胞膜上可見(jiàn)散在的極強(qiáng)的綠色熒光顆粒；而將對(duì)照組中不同來(lái)源的多抗血清用上述方法進(jìn)行觀察,只有兔抗登革病毒多抗血清組可見(jiàn)比P1多抗血清組更密集的綠色熒光顆粒,其它組別未見(jiàn)有綠色熒光顆粒。 小鼠致敏脾淋巴細(xì)胞分離后體外培養(yǎng),分別加入不同刺激原(P1、P2、PHA和PBS),觀察不同刺激原對(duì)致敏淋巴細(xì)胞增殖的影響。小鼠的致敏脾淋巴細(xì)胞在受到致敏原的再刺激時(shí),淋巴細(xì)胞發(fā)生了增殖。P1的刺激指數(shù)(stimulation index, SI, SI1.1為陽(yáng)性)為2.368±0.488；P2同時(shí)也含有PADRE表位,其淋巴細(xì)胞增殖中也檢測(cè)到具有刺激效應(yīng),SI分別為1.656±0.31；亞適量PHA的SI為1.56±0.320；PBS刺激指數(shù)為0.862±0.075。經(jīng)one-way ANOVA方差分析結(jié)果表明,不同刺激原刺激致敏脾淋巴細(xì)胞時(shí),刺激指數(shù)有顯著差異性(F=17.114,P0.001)。P1多表位肽再次刺激致敏脾淋巴細(xì)胞時(shí),刺激指數(shù)顯著高于其他組別(P0.005)。 在細(xì)胞因子染色實(shí)驗(yàn)中,小鼠致敏脾淋巴細(xì)胞分離后體外培養(yǎng),分別加入不同刺激原(P1、P2和PBS),采用FACScom軟件散點(diǎn)圖設(shè)門(mén)區(qū)CD3+和CD8-區(qū)分Th細(xì)胞(CD4+),最終以IFN-γ和IL-4散點(diǎn)圖表示Thl和Th2細(xì)胞。P1組的Th1細(xì)胞比率為3.332±1.17,P2組的Th1細(xì)胞比率為0.685±0.262,PBS組的Th1細(xì)胞比率為0.6075±0.276。采用one-way ANOVA分析,由于方差不齊,故采用近似F檢驗(yàn)Welch法,結(jié)果顯示不同組間的Th1細(xì)胞比率有顯著差異(F=9.207,P=0.018)。以Dunnett T3法進(jìn)行組間多重比較,P1組的Th1細(xì)胞比率較P2組和PBS組高(P0.05)。P1組的Th2細(xì)胞比率為1.13±0.747,P2組的Th2細(xì)胞比率0.47±0.253,PBS組的Th2細(xì)胞比率為0.48±0.344,同樣采用近似F檢驗(yàn)Welch法分析Th2細(xì)胞比率發(fā)現(xiàn),各組間無(wú)差異性(F=1.282,P=0.35)。 3、不同免疫組別(P1、P2和PBS組)和空白組的小鼠腹腔感染DEN-2 NGC后,Real-time PCR法檢測(cè)小鼠外周血中的病毒載量,P1免疫組的小鼠僅于感染后第1天能測(cè)到低拷貝的病毒(3.8±2.674,單位103copies/mL),而后第3和5天均未檢測(cè)到病毒。而P2、PBS免疫組和空白組小鼠感染病毒后,第1、3和5天病毒載量分別為5.22±1.888,75±24.595,2.86±0.952,(單位103 copies/mL);6.02±2.203,16.84±7.267,2.7±0.734,(單位103 copies/mL); 13.24±8.915,15898±7.601,33.38±20.28,(單位103 copies/mL)。重復(fù)測(cè)量方差分析(ANOVA for the repeated measures)結(jié)果顯示不同組間的病毒載量有非常顯著性差異(F=21.92,P0.001)；不同時(shí)間點(diǎn)檢查的病毒載量差異性也非常顯著(F=22.02,P0.001)；組別同時(shí)間之間有交互作用(不同組隨時(shí)間變化,病毒載量變化不同,F=21.72,P0.001)。以one-way ANOVA對(duì)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行組間分析,感染后1、3和5天,組間具有顯著性差異(P0.05)。 不同免疫組別的多抗血清倍比稀釋后,等體積與100 TCID50 DEN-2 NGC株共孵育,再感染Vero細(xì)胞,每日觀察見(jiàn)P1組多抗血清稀釋1：64時(shí)可抑制50%的細(xì)胞病變,而其它對(duì)照組(P2和PBS多抗血清組)在任何稀釋梯度下均未觀察到抑制細(xì)胞病變的現(xiàn)象。 結(jié)論 1、生物信息學(xué)分析表明,表位肽P1具有型特異性、免疫原性和信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。 2、P1為完全抗原,即有免疫原性又有反應(yīng)原性。P1肽可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生極高的抗體滴度,同時(shí)免疫后的雙表位抗血清可與登革病毒結(jié)合。P1作為刺激原,可誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞發(fā)轉(zhuǎn)化,使Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞漂移,以增加CTL細(xì)胞效應(yīng)。 3、免疫P1的C57BL/6j小鼠可以產(chǎn)生中和DEN-2 NGC的抗體,當(dāng)免疫小鼠感染DEN-2 NGC后,僅于感染后第一天可測(cè)到低拷貝的病毒。P1多表位肽可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1758037