本文選題：內(nèi)皮祖細(xì)胞 + 低氧�。� 參考：《浙江大學(xué)》2008年博士論文

【摘要】： 越來越多的證據(jù)表明損傷器官的修復(fù)不僅包括受損部位鄰近細(xì)胞的增值和遷移還包括其他部位干細(xì)胞的參與。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一類能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前提細(xì)胞,其特征性的表達(dá)cD34、KDR及CD133。研究表明EPCs在缺血組織的血管新生(revascularizatioa)及受損血管的再內(nèi)皮化(re-endothelialization)中起到了重要的作用。當(dāng)受到如缺血組織釋放的各種細(xì)胞因子的刺激,內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓進(jìn)入血液循環(huán)(mobilization),到達(dá)需要組織修復(fù)的部位或受損血管(homing)分化成為內(nèi)皮細(xì)胞(differentiation),并釋放多種可以促進(jìn)局部內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖的細(xì)胞因子。EPCs移植在心血管疾病治療中有廣泛的應(yīng)用前景,其可以改善心肌梗死患者的心功能,減少心肌重塑,增加下肢缺血病人的運(yùn)動耐量。 低氧與心絞痛,心肌梗死,心力衰竭及外周動脈疾病密切相關(guān),低氧和組織缺血多由于血管閉塞或由于高血壓所致功能及解剖性微血管稀疏所致。降低的氧濃度刺激機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng),例如內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,血管生成(angiogenesis)等,從而緩解局部缺氧。為適應(yīng)低氧刺激,細(xì)胞內(nèi)多種信號分子被激活,其中低氧誘導(dǎo)分子(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境的關(guān)鍵信號分子。晚近研究表明,低氧微環(huán)境(如缺血組織,受損血管)通過HIF-1路徑刺激局部細(xì)胞釋放內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)從而促進(jìn)EPCs的動員及歸巢。但低氧微環(huán)境對EPCs遷移及凋亡的影響,目前還不清楚。 基于上述理論,我們提出假設(shè):低氧可以影響EPCs的功能,繼而影響受損血管內(nèi)皮修復(fù)能力及血管生成,進(jìn)而影響一系列心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前國內(nèi)外有關(guān)低氧對EPCs功能的影響及其機(jī)制的研究尚很少。為此,我們首先觀察了體外低氧對外周血EPCs功能的影響,隨后進(jìn)一步探討了低氧影響EPCs功能的可能機(jī)制。以下分兩部分對本研究的方法、結(jié)果以及結(jié)論作一簡述。 第一部分低氧對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響 目的:觀察體外低氧對外周血EPCs功能的影響。 方法:采用密度梯度離心法從人外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞,將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板,培養(yǎng)7d,細(xì)胞同步化后放入低氧微環(huán)境(2%O_2)干預(yù)。多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs,流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志進(jìn)一步鑒定EPCs。采用改良的Boyden小室、MTT比色法、FITC-Annexin V/PI流式細(xì)胞儀檢測、TUNEL染色法分別觀察EPCs的遷移能力、細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果:低氧24h能顯著增強(qiáng)外周血EPCs向SDF-1a(100ng/mL)的遷移能力。去血清48h,EPCs細(xì)胞活力明顯下降,細(xì)胞凋亡明顯增多,低氧24h可以延緩去血清誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低,抑制去血清誘導(dǎo)的EPCs凋亡(與對照組比較,遷移能力58.57±10.49 vs 38.57±7.48,細(xì)胞活力0.74±0.13 vs 0.62±0.09,凋亡情況27.87%±2.03%vs 32.43%±3.11%)。 結(jié)論:低氧可增強(qiáng)EPCs遷移能力,抑制EPCs活力下降及凋亡。 第二部分低氧對內(nèi)皮祖細(xì)胞功能影響的機(jī)制探討 目的:研究低氧增強(qiáng)EPCs遷移及抑制其凋亡的機(jī)制。 方法:采用密度梯度離心法從人外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞,將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板,培養(yǎng)7d后,多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽性細(xì)胞為EPCs,流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志進(jìn)一步鑒定EPCs。培養(yǎng)7d后,細(xì)胞同步化后,EPC s低氧培養(yǎng)24h干預(yù)或先予以磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated protein kinase1/2,ERK1/2)抑制劑預(yù)處理1h后干預(yù),RT-PCR檢測SDF-1α受體CXCR4 mRNA的表達(dá);流式細(xì)胞儀測定CXCR4表達(dá)率、改良的Boyden小室測量EPCs向SDF-1α(100ng/mL)的遷移能力。FITC-Annexin V/PI流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。Western blot檢測EPCs Akt、ERK1/2、GSK-3β(Glycogen synthasekina se-3β)磷酸化水平及HIF-1α蛋白水平。采用MTT比色法觀察EPCs的活力。 結(jié)果:低氧24h,EPCs向SDF-1a(100ng/mL)的遷移能力明顯增強(qiáng),SDF-1α受體CXCR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組,CXCR4特異性阻斷劑AMD3100和PI3K抑制劑(LY294002)可以近乎完全抑制增強(qiáng)的遷移能力,并且后者可以明顯抑制低氧誘導(dǎo)的CXCR4表達(dá)增高。而ERK1/2抑制劑(PD98059)則對CXCR4的表達(dá)及EPCs的遷移能力沒有明顯作用。研究還發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑(LY294002)可以近乎完全的抵消低氧抑制的去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的EPCs活力下降及凋亡,而PD98059則無明顯作用。western blot檢測顯示低氧可以促進(jìn)EPCs Akt、ERK1/2、GSK-3β的磷酸化和HIF-1α蛋白水平的增加。 結(jié)論:低氧可增加EPCs受體CXCR4的表達(dá),抑制EPCs凋亡;PI3K/Akt而非ERK1/2信號途徑參與低氧誘導(dǎo)的CXCR4表達(dá)上調(diào)及抑制的細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:Endothelial progenitor cells ( EPCs ) are a kind of prerequisite cells which can proliferate and differentiate into vascular endothelial cells . The study shows that EPCs can be differentiated into endothelial cells and release a variety of cytokines which can promote the migration and proliferation of local endothelial cells .



Hypoxia and angina pectoris , myocardial infarction , heart failure and peripheral artery disease are closely related , hypoxia and ischemia are caused by vascular occlusion or due to hypertension .



On the basis of the above theory , we put forward that hypoxia can affect the function of EPCs , then affect the repair ability of injured vascular endothelium and angiogenesis , and then influence the development of a series of cardiovascular diseases . At present , we first observed the effect of hypoxia on EPCs function and the possible mechanism of hypoxia on EPCs function .



Effect of first part hypoxia on the function of endothelial progenitor cells in peripheral blood



Objective : To observe the effect of hypoxia on the function of EPCs in peripheral blood .



Methods : Single nuclear cells were obtained from human peripheral blood by density gradient centrifugation . The cells were inoculated into cultured plates coated with human fibronectin . After 7 days of incubation , the cells were synchronized and then placed in hypoxic microenvironment ( 2 % O2 ) . The surface markers of FITC - UEA - I and DiI - acLDL were detected by multi - wavelength laser confocal microscope . The migration ability , cell viability and apoptosis of EPCs were observed by using modified Boyden chamber , MTT colorimetric method , FITC - annexing V / PI flow cytometry .



Results : After 24 hours of hypoxia , the cell viability of EPCs decreased significantly , and the apoptosis of EPCs decreased significantly . The apoptosis of EPCs induced by serum was decreased and the apoptosis of EPCs induced by serum was decreased ( 58.57 鹵 10.49 vs 38.57 鹵 7.48 , cell viability was 0.74 鹵 0.13 vs 0.62 鹵 0.09 , and apoptosis was 27.87 % 鹵 2 . 03 % vs 32.43 % 鹵 3.11 % ) .



Conclusion : Hypoxia can enhance EPCs migration ability , inhibit EPCs activity decline and apoptosis .



Study on the mechanism of hypoxia on endothelial progenitor cell function in the second part



Objective : To study the mechanism of hypoxia - enhanced EPCs migration and the inhibition of apoptosis .



Methods : Human peripheral blood mononuclear cells were isolated from human peripheral blood by density gradient centrifugation . After 7 days of culture , FITC - UEA - I and DiI - acLDL double staining positive cells were identified as EPCs . After 7 days of incubation , the expression of CXCR4 mRNA was detected by flow cytometry . The expression rate of CXCR4 mRNA was detected by flow cytometry . The phosphorylation level and HIF - 1偽 protein level of EPCs were detected by flow cytometry . The activity of EPCs was observed by MTT assay .



Results : The expression level of CXCR4 mRNA and protein in EPCs was significantly higher than that of control group . The expression of CXCR4 mRNA and protein in EPCs was significantly higher than that of control group .



Conclusion : Hypoxia can increase the expression of CXCR4 in EPCs , inhibit the apoptosis of EPCs , inhibit the expression of CXCR4 in hypoxia - induced CXCR4 expression and inhibit the apoptosis of EPCs .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R363

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1754227