發(fā)布時(shí)間：2018-04-14 01:33

  本文選題：耐亞胺培南銅綠假單胞菌 + 金屬β-內(nèi)酰胺酶�。� 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】：目的：銅綠假單胞菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染常見的條件致病菌之一,其對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜,獲得并表達(dá)金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamase,MBL)是銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制之一。具有捕獲及表達(dá)外來基因能力的整合子-基因盒系統(tǒng)在金屬酶基因的快速播散中意義重大,其介導(dǎo)的多種耐藥基因也是造成銅綠假單胞菌多重耐藥的重要原因之一。本課題選取天津地區(qū)四所三級(jí)甲等醫(yī)院臨床分離的耐亞胺培南銅綠假單胞菌(imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, IRPA)為研究對(duì)象,分析其對(duì)常見抗菌藥物的耐藥性,研究金屬β-內(nèi)酰胺酶和Ⅰ類整合子的流行情況,并對(duì)銅綠假單胞菌所攜帶的IMP-1基因進(jìn)行定位,確定其是否位于整合子上;最后從IMP-1型金屬酶基因mRNA表達(dá)的角度,對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬酶情況和細(xì)菌對(duì)亞胺培南耐藥性之間的關(guān)系進(jìn)行分析。 方法：選取2007年1月-12月天津市四所三級(jí)甲等醫(yī)院分離出的67株耐亞胺培南銅綠假單胞菌為受試菌,采用K-B法對(duì)所有菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),并比較其對(duì)不同抗菌藥物的耐藥性；用EDTA紙片協(xié)同抑制試驗(yàn)對(duì)亞胺培南耐藥株進(jìn)行金屬酶表型篩選,并用PCR方法擴(kuò)增IMP和VIM型金屬酶基因：采用PCR方法擴(kuò)增I類整合酶基因,對(duì)整合酶陽性株進(jìn)行可變區(qū)的PCR擴(kuò)增并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,將測序結(jié)果在Genbank上行同源性分析,確定可變區(qū)攜帶的基因盒；采用PCR方法對(duì)IMP-1基因進(jìn)行定位；最后利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法,檢測IMP-1mRNA的表達(dá)量,分析其表達(dá)量與細(xì)菌對(duì)亞胺培南MIC之間的關(guān)系。 結(jié)果： 1.67株臨床分離的耐亞胺培南銅綠假單胞菌均為多重耐藥菌株,藥敏結(jié)果示：受試菌耐藥情況嚴(yán)重,對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率接近100%：對(duì)慶大霉素、氯霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率超過了70%,對(duì)阿米卡星的耐藥率接近60%,對(duì)頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率在40%左右,對(duì)氨曲南的耐藥率最低,為31.34%。 2.PCR結(jié)果顯示,在67株耐亞胺培南銅綠假單胞菌中,有19株攜帶IMP-1型金屬酶基因,檢出率接近28%,其中有16株金屬酶表型篩選實(shí)驗(yàn)陽性；在這19株IMP-1基因陽性株中,有15株攜帶的IMP-1基因位于Ⅰ類整合子上,與aadB氨基糖苷耐藥基因共同位于整合子可變區(qū)中。 3.在67株耐亞胺培南銅綠假單胞菌中,檢出46株銅綠假單胞菌攜帶I類整合酶基因,陽性率68.65%,其中有2株檢出可變區(qū)結(jié)構(gòu),1株(PA60)可變區(qū)為aadB和cm1A基因,其序列與Genbank中目標(biāo)基因(DQ266448)中兩基因序列100%一致；另1株(PA27)可變區(qū)為aac(6')-Ⅱ-cm1A8-OXA-10,確定為一種新型耐藥基因盒組合形式,GenBank登錄號(hào)為EU708817。 4.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：Group1(低MIC組)和Group2(高M(jìn)IC組)兩組樣本IMP-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026), Group1(低MIC組)的(?)mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于Group2(高M(jìn)IC組),亞胺培南耐藥與IMP-1表達(dá)存在一定的相關(guān)性。 結(jié)論：67株耐亞胺培南銅綠假單胞菌可選擇抗生素有限,對(duì)氨曲南和頭孢他啶的耐藥性較低,分別為31.34和40.30%；19株攜帶IMP-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶(28%),與國內(nèi)外其他地區(qū)報(bào)道相近,其中大多數(shù)菌株攜帶的IMP-1基因位于I類整合子上,表明整合子在金屬酶基因的快速播散中意義重大；同時(shí)I類整合酶基因廣泛分布在耐亞胺培南銅綠假單胞菌中,此外本研究還檢出1株攜帶新型基因盒組合形式I類整合子的銅綠假單胞菌,表明了整合子-基因盒系統(tǒng)的高度異質(zhì)性；通過對(duì)IMP-1基因mRNA目對(duì)表達(dá)量的檢測,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對(duì)亞胺培南的MIC與該基因mRNA的表達(dá)升高有關(guān)。
[Abstract]:Objective: Pseudomonas aeruginosa is a common nosocomial infection caused by pathogens of the antimicrobial resistance mechanism is very complex, and the expression of metallo beta lactamase (metallo- beta -lactamase, MBL) is one of the main mechanisms of Pseudomonas aeruginosa resistant to carbapenems. With rapid spread integron - ability to capture and express foreign genes gene cassette system in metal enzyme gene is significant, one of the important reasons of multiple drug resistance genes mediated is caused by multi drug resistant Pseudomonas aeruginosa. Imipenem resistant Pseudomonas aeruginosa the selected clinical isolates in Tianjin area from four to three hospitals (imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, IRPA) as the research object, analysis of their resistance to common antibiotics, research of MBLS and integron epidemic situation, and The location of IMP-1 gene carried by Pseudomonas aeruginosa was located to determine whether it was located on integron. Finally, the relationship between metalloenzyme and Pseudomonas aeruginosa resistance to imipenem was analyzed from the angle of IMP-1 metalloproteinase gene mRNA expression.
Methods: January 2007 -12 month four Tianjin City three hospitals 67 strains of imipenem resistant Pseudomonas aeruginosa as tested bacteria, the drug susceptibility tests were performed on all strains by K-B method, and compare the drug resistance to different antibiotics; EDTA synergy inhibition test of metal enzyme phenotype screening the imipenem resistant strains, and amplified by PCR IMP and VIM metal enzyme gene amplification: class I integrase gene by PCR method of variable region of the integrase positive strains were amplified by PCR and the PCR products were sequenced. The sequencing results in analysis of Genbank homologous gene upstream, to determine the variable region carrying box by using PCR method; the localization of IMP-1 gene; finally, using the method of real-time fluorescence quantitative RT-PCR, detect the expression of IMP-1mRNA and analyze its expression and the relationship between bacteria to imipenem and MIC.
Result:
1.67 strains of imipenem resistant Pseudomonas aeruginosa strains clinical isolates were multi drug resistant strains and drug sensitivity showed that the tested strains resistant to imipenem, meropenem resistance rate is close to 100% of gentamicin, chloramphenicol and ciprofloxacin resistance rate of more than 70% of Amikacin's drug resistance rate close to 60% of cephalosporins ceftazidime, Cefoperazone / sulbactam in 40%, resistant to aztreonam was the lowest, 31.34%.
2.PCR results showed that the imipenem resistant Pseudomonas aeruginosa in 67 strains, 19 strains carrying IMP-1 metal enzyme gene, the detection rate of close to 28%, of which 16 strains of metal enzyme phenotype screening test positive; in the 19 strains of IMP-1 gene positive strains, 15 strains carrying the IMP-1 gene in class I integron aadB, Co located with the aminoglycoside resistance gene of integron in the variable regions.
3. of the 67 strains of imipenem resistant Pseudomonas aeruginosa, were detected in 46 strains of Pseudomonas aeruginosa I gene, the positive rate was 68.65%, of which 2 strains of variable region structure, 1 strains (PA60) for aadB and cm1A variable region gene, target gene and the sequence of Genbank (DQ266448). The two gene sequences of 100%; the other 1 strains (PA27) variable region (6') - AAC II -cm1A8-OXA-10, identified as a new resistance gene cassette combinations, GenBank accession number is EU708817.
4. real time fluorescence quantitative RT-PCR and statistical results showed that the Group1 (low MIC group) and Group2 (high MIC group) of two samples of IMP-1 gene mRNA expression was statistically significant difference (P=0.026), Group1 (low MIC group) of the (?) the relative expression of mRNA was significantly lower than that of Group2 (high MIC group). There is a correlation between the expression of imipenem resistance and IMP-1.
Conclusion: 67 strains of imipenem resistant Pseudomonas aeruginosa can choose antibiotics limited, low resistance to aztreonam and ceftazidime, respectively 31.34 and 40.30%; 19 strains carrying IMP-1 metallo (28%), with similar reports of other regions at home and abroad, the majority of strains carrying IMP-1 gene in the class I integron, showed that the rapid spread of integron in metal enzyme gene in great significance; at the same time the class I integrase gene is widely distributed in imipenem resistant Pseudomonas aeruginosa in addition, this study also detected 1 strains of Pseudomonas aeruginosa carrying new array of gene cassettes type I integron. Show the high heterogeneity of the integron gene cassette system; based on the IMP-1 gene to detect the expression of mRNA, that the higher expression of bacteria to imipenem and the MIC gene of mRNA.

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R378.991

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