發(fā)布時(shí)間：2018-04-12 16:50

  本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞 + 臍帶��； 參考：《南昌大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 目的本研究旨在建立一種分離、培養(yǎng)擴(kuò)增臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的方法,通過(guò)對(duì)其基本生物學(xué)特性、體外誘導(dǎo)分化能力、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein GFP)基因質(zhì)粒對(duì)其標(biāo)記示蹤的可能性及體內(nèi)移植促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)的可行性等的研究,以期為組織工程種子細(xì)胞提供新的細(xì)胞來(lái)源,為燒傷、腫瘤等導(dǎo)致的皮膚缺損患者的臨床治療提供新思路。 方法1、首先建立hUC-MSCs分離和培養(yǎng)擴(kuò)增的方法并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖的研究、細(xì)胞免疫表型分析及體外誘導(dǎo)分化能力的檢測(cè)對(duì)其基本生物學(xué)特性進(jìn)行研究并與生物學(xué)特性研究較多的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilicalcord blood hUCB-MSCs)進(jìn)行比較(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Bone marrow mesenchymal stem cells BM-MSCs的生物學(xué)特性研究最多,但本實(shí)驗(yàn)由于骨髓標(biāo)本來(lái)源受限)。2、將已轉(zhuǎn)化的GFP-N2大腸桿菌109菌種,進(jìn)行質(zhì)粒提取,脂質(zhì)體(lipofectamine 2000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染hUC-MSCs,分別于轉(zhuǎn)染24h,96h后計(jì)算熒光的轉(zhuǎn)染效率,以未標(biāo)記的同期細(xì)胞作為對(duì)照。3、將已標(biāo)記綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒的hUC-MSCs移植至表皮缺損的裸鼠表皮缺損處,采用組織切片、免疫熒光等方法檢測(cè)裸鼠表皮愈合及hUC-MSCs在皮膚缺損處的分布。 結(jié)果1、hUC-MSCs接種后24-48h貼壁,成纖維細(xì)胞樣克隆形成(Unit-fibroblast like colony-forming,CFU-F)時(shí)間為5-7d,首次傳代時(shí)間為12-16d,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞倍增時(shí)間為29h,均較hUCB-MSCs短。免疫表型分析顯示hUC-MSCs和hUCB-MSCs均表達(dá)粘附分子和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD13、CD29、CD105、CD166,不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD14、CD34、CD45,不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31,兩者表型基本一致,無(wú)明顯區(qū)別。此外,實(shí)驗(yàn)還證實(shí)hUC-MSCs具有向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力。2、綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hUC-MSCs 24h后綠色熒光表達(dá)率為37%,而且短期內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),表達(dá)率有上升趨勢(shì)。3、實(shí)驗(yàn)組裸鼠大體觀察表皮愈合較對(duì)照組好,組織切片見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組皮膚結(jié)構(gòu)層次較清晰而對(duì)照組大多數(shù)為疤痕愈合,結(jié)構(gòu)層次不清楚,免疫熒光觀察見(jiàn)hUC-MSCs在表皮缺損愈合的新生血管中有存活,對(duì)照組為陰性。 結(jié)論1、成功建立了從人足月臍帶中分離培養(yǎng)擴(kuò)增hUC-MSCs的方法,操作簡(jiǎn)單、易行,分離培養(yǎng)的hUC-MSCs具有MSCs的基本生物學(xué)特性和免疫表型,且比hUCB-MSCs含量更豐富,具有更強(qiáng)的增殖能力,可以作為組織工程新的細(xì)胞來(lái)源。 2、脂質(zhì)體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs標(biāo)記示蹤技術(shù)是一種理想的較穩(wěn)定示蹤標(biāo)記技術(shù),可以應(yīng)用為組織工程種子細(xì)胞示蹤的實(shí)驗(yàn)研究。 3、hUC-MSCs機(jī)體內(nèi)移植能促進(jìn)皮膚缺損的愈合,可為皮膚缺損患者的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to establish a method for isolating and amplifying human umbilical cord derived mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) from umbilical cord derived mesenchymal stem cells.The possibility of labeling green fluorescent protein GFP gene plasmid and the feasibility of in vivo transplantation to promote the repair of skin wound were studied in order to provide a new cell source for tissue engineering seed cells and burn injury.The clinical treatment of skin defect caused by tumor provides a new idea.Methods 1.Firstly, the method of hUC-MSCs isolation and culture was established, and the cell proliferation was studied by means of cell morphology and cell proliferation.The basic biological characteristics of human umbilicalcord blood hUCB-MSCs were compared with those of cord blood mesenchymal stem cells (umbilicalcord blood hUCB-MSCs).The biological characteristics of Bone marrow mesenchymal stem cells BM-MSCs were studied most frequently.However, due to the limited origin of bone marrow specimens, the transformed strain of GFP-N2 Escherichia coli 109 was extracted and transfected into hUC-MSCs mediated by liposome lipofectamine 2000. The transfection efficiency was calculated after transfection for 24 h or 96 h, respectively.The hUC-MSCs labeled with green fluorescent protein gene plasmid was transplanted into the epidermal defect of nude mice with unlabeled synchronous cells as control. Tissue sections were used.The epidermal healing and the distribution of hUC-MSCs in skin defect of nude mice were detected by immunofluorescence.Results (1) 24 to 48 h after inoculation of hUC-MSCs, fibroblast-like like colony-forming CFU-F was found to be 5-7 days, the first passage time was 12-16 days, and the logarithmic cell doubling time was 29 h, which was shorter than that of hUCB-MSCs.Immunophenotypic analysis showed that both hUC-MSCs and hUCB-MSCs expressed adhesion molecule and stromal cell marker CD13, CD29, CD105, CD166, hematopoietic marker CD14, CD34, CD45, and endothelial cell labeled CD31. The phenotypes of the two were basically the same, but there was no significant difference between them.In addition, hUC-MSCs had the ability of inducing differentiation into osteoblasts and adipocytes. The green fluorescent expression rate of hUC-MSCs transfected with green fluorescent protein gene plasmid was 37% 24 hours after transfection.The expression rate showed an upward trend. The experimental group showed that the epidermal healing was better than that of the control group, and the skin structure of the experimental group was clear, while the control group was mostly scar healing, and the structure level was not clear.Immunofluorescence observation showed that hUC-MSCs survived in the neovascularization of epidermal defect healing, but negative in the control group.Conclusion 1. The method of isolating and amplifying hUC-MSCs from human umbilical cord has been successfully established. The method is simple and easy to operate. The isolated and cultured hUC-MSCs has the basic biological characteristics and immunophenotype of MSCs, and the content of MSCs is more abundant than that of hUCB-MSCs, and it has stronger proliferative ability.It can be used as a new cell source for tissue engineering.2. Liposome mediated green fluorescent protein gene plasmid transfection with hUC-MSCs labeled tracer technique is an ideal and stable tracer technique, which can be used as a tracer for tissue engineering seed cells.In vivo transplantation of hUC-MSCs can promote the healing of skin defects and provide a theoretical basis for the clinical treatment of skin defects.
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：1740597