本文選題：香煙煙霧提取物 + G-蛋白耦聯(lián)受體　； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 1研究目的 吸煙是動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、中風(fēng)、外周血管疾病等心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一。大量研究表明,吸煙能導(dǎo)致血管壁損傷及血管內(nèi)皮的局部功能紊亂,并能增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣斑塊形成。血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表面及細(xì)胞內(nèi)分布著不同類型的受體,其中分布在細(xì)胞膜上的G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)家族是最重要的一類受體,與心血管疾病關(guān)系密切。大量實(shí)驗(yàn)與臨床結(jié)果報(bào)道了生理或病理?xiàng)l件下GPCR的調(diào)控,GPCR對(duì)于血管收縮起重要作用,GPCR的活化可調(diào)節(jié)血流和血壓水平,GPCR介導(dǎo)的VSMC收縮和增殖異常是血管疾病發(fā)展的重要因素。然而,對(duì)于吸煙伴隨心血管疾病發(fā)病率增高的分子機(jī)制仍未完全闡明。 本研究的目的旨在探討器官培養(yǎng)及香煙煙霧提取物(DSP)對(duì)腎動(dòng)脈血管平滑肌GPCR的影響,闡明其可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,由此對(duì)于揭示吸煙相關(guān)GPCR紊亂所致的心腦血管疾病的發(fā)病機(jī)理、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)具有重要意義。 2方法 采用大鼠腎動(dòng)脈體外器官培養(yǎng)模型,將分離得到的大鼠腎動(dòng)脈,去除內(nèi)皮,制成1~1.5mm的血管環(huán)進(jìn)行器官培養(yǎng)。將特異性或非特異性的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路抑制劑加到培養(yǎng)基中,以檢驗(yàn)不同信號(hào)通路的參與情況。培養(yǎng)結(jié)束后,用靈敏的肌張力描記技術(shù)記錄血管環(huán)的張力變化,依次在血管環(huán)浴槽中加入選擇性受體激動(dòng)劑以觀察血栓素A2受體(TP)、內(nèi)皮素受體A (ETA)和內(nèi)皮素受體B(ETB)等GPCR介導(dǎo)的血管收縮;以實(shí)時(shí)在線反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time RT-PCR)技術(shù)定量檢測(cè)受體的mRNA表達(dá);用免疫組織化學(xué)染色法結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定受體的蛋白表達(dá),闡明其可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 在單純器官培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,將吸煙這一心血管疾病的危險(xiǎn)因子以香煙煙霧提取物DSP的形式引入培養(yǎng)體系,按上述方法從血管收縮功能、受體的mRNA表達(dá)量以及受體的蛋白表達(dá)水平三個(gè)方面探討DSP對(duì)腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞TP、ETA和ETB受體等GPCR的影響及機(jī)制。 3結(jié)果 大鼠腎動(dòng)脈經(jīng)過24 h的培養(yǎng),平滑肌細(xì)胞中TP下調(diào)。不同通路抑制劑使用后發(fā)現(xiàn)TP的下調(diào)未被非選擇性翻譯抑制劑CHX影響,但幾乎完全被非選擇性轉(zhuǎn)錄抑制劑ACD所消除,RT-PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示TP mRNA表達(dá)和TP蛋白表達(dá)水平下降,提示TP下調(diào)可能與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄機(jī)制有關(guān)。進(jìn)一步使用MAPK通路抑制劑后的研究表明,TP介導(dǎo)的收縮反應(yīng)未被JNK和p38通路抑制劑SP600125和SB203580影響,但被ERK1/2通路抑制劑U0126部分程度地消除,說明TP的下調(diào)可能與激活ERK1/2信號(hào)通路有關(guān);蛋白酶體抑制劑MG-132和與NF-κB信號(hào)通路抑制劑BMS345541可以明顯消除器官培養(yǎng)所致的TP下調(diào),顯示ERK1/2的下游通路NF-κB也參與TP下調(diào),IκBα和IκBβ信號(hào)通路均與此有關(guān)。 器官培養(yǎng)導(dǎo)致ETA和ETB受體上調(diào)。ERK1/2通路抑制劑U0126和p38通路抑制劑SB203580抑制了ETB受體介導(dǎo)的這種增強(qiáng)的收縮反應(yīng);而對(duì)于ETA受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng),U0126,SP600125和SB203580均沒有明顯影響。ETB受體上調(diào)可能與ERK1/2及P38信號(hào)通路及下游NF-κB途徑有關(guān),而ETA受體的上調(diào)可能與MAPK信號(hào)通路及下游NF-κB途徑無關(guān)。此外,蛋白酶體抑制劑MG-132消除了器官培養(yǎng)所導(dǎo)致的TP下調(diào)或ETA和ETB受體上調(diào),但磷酸二酯酶并未參與其中。器官培養(yǎng)24h后,Il-6和Il-1β的mRNA表達(dá)增高明顯。 腎動(dòng)脈血管環(huán)在與DSP共同培養(yǎng)后,ETB、ETA和TP受體介導(dǎo)的平滑肌收縮反應(yīng)明顯增強(qiáng),且這種增強(qiáng)與DSP的濃度在一定范圍內(nèi)(0.1～0.4μlmL-1)呈濃度-效應(yīng)依賴關(guān)系;此外,ETB受體介導(dǎo)的平滑肌收縮反應(yīng)增強(qiáng)的程度和與DSP共同培養(yǎng)的時(shí)間在一定范圍內(nèi)(0～24h)呈時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。ETB受體的mRNA表達(dá)水平在與DSP共同培養(yǎng)后明顯增加,但DSP的加入并未使ETA和TP受體的mRNA表達(dá)水平發(fā)生變化。免疫組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與DSP共同培養(yǎng)后,在腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中TP、ETB和ETA受體的蛋白表達(dá)水平明顯增高。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路研究結(jié)果顯示,DSP所致ETB受體水平的上調(diào)可以被NF-κB信號(hào)通路抑制劑BMS345541完全消除,而TP和ETA受體上調(diào)卻不被BMS345541所影響。以上結(jié)果提示DSP引起的ETB受體改變可能與轉(zhuǎn)錄機(jī)制有關(guān),而TP和ETA受體可能與轉(zhuǎn)錄后機(jī)制相關(guān)。盡管較高濃度的內(nèi)毒素(LPS)表現(xiàn)出上調(diào)ET受體的作用,但LPS和尼古丁可能均不是DSP中引起上述受體改變的關(guān)鍵成分。 4結(jié)論 器官培養(yǎng)能夠引起大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞TP水平下調(diào), ETB和ETA受體水平上調(diào)。TP下調(diào)可能與細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的下游NF-κB通路有關(guān),ETB受體上調(diào)可能與ERK1/2及P38信號(hào)通路及下游NF-κB途徑有關(guān),而ETA受體的上調(diào)可能與MAPK信號(hào)通路及下游NF-κB途徑無關(guān)。 DSP能夠引起大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞ETB、ETA和TP受體水平上調(diào)。DSP引起ETB受體水平上調(diào)的機(jī)制可能與激活轉(zhuǎn)錄因子NF-кB途徑有關(guān);ETA和TP受體的上調(diào)則可能與轉(zhuǎn)錄后機(jī)制有關(guān)。LPS和尼古丁可能均不是DSP中引起上述受體改變的關(guān)鍵成分。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1736276