本文選題：細(xì)胞凋亡 + CHO��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年碩士論文

【摘要】： 哺乳動物細(xì)胞是表達(dá)具有天然活性蛋白的最佳宿主。其優(yōu)勢在于能正確有效地識別真核蛋白的合成、加工和分泌信號,識別和去除基因中的內(nèi)含子,再經(jīng)剪切加工成為成熟的mRNA,能準(zhǔn)確地完成糖基化、磷酸化,形成鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵以及蛋白水解等翻譯后加工過程,因而產(chǎn)生的完整抗體和天然抗體一樣具有生物學(xué)活性,既可識別抗原又可激活補(bǔ)體系統(tǒng)。哺乳動物細(xì)胞易被重組的DNA轉(zhuǎn)染,經(jīng)過篩選可得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性,表達(dá)的產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中易于純化。利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)蛋白產(chǎn)物已廣泛應(yīng)用于生物制品工業(yè),如病毒疫苗、抗體、干擾素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素和生長因子等的大量制備。但哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)也很明顯,如表達(dá)量低、大規(guī)模培養(yǎng)困難、生產(chǎn)成本高昂等。目前,國內(nèi)應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行基因工程制藥、抗體工程的研究多數(shù)停留在前期和上游階段,進(jìn)入實(shí)質(zhì)性生產(chǎn)的極少。這種狀況的產(chǎn)生主要因?yàn)闃?gòu)建的細(xì)胞株不適于大規(guī)模培養(yǎng)。因?yàn)楣こ碳?xì)胞株除了要求目的蛋白的表達(dá)量高外,還必須適應(yīng)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng);必須具有對不利環(huán)境的抵抗能力,如抗凋亡能力。工程細(xì)胞上述能力的獲得僅由培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件優(yōu)化設(shè)計(jì)很難從根本上解決哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)存在的問題,隨著對細(xì)胞代謝途徑和調(diào)控機(jī)理的深入研究,越來越多的研究者將研究方向轉(zhuǎn)向針對細(xì)胞本身進(jìn)行改造的代謝工程,通過代謝工程,從哺乳動物細(xì)胞內(nèi)部重新設(shè)計(jì)改造細(xì)胞,使細(xì)胞更堅(jiān)固,適應(yīng)能力更強(qiáng),具備在體外培養(yǎng)條件下的自身調(diào)節(jié)能力,從而適應(yīng)產(chǎn)業(yè)化規(guī)模培養(yǎng)的要求。鑒于中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞是目前基因工程制藥最常用的哺乳動物宿主細(xì)胞,本研究對CHO細(xì)胞的部分基因進(jìn)行了過表達(dá)及調(diào)控表達(dá),從不同角度多對CHO細(xì)胞進(jìn)行了改造,以期獲得上述能力。實(shí)驗(yàn)分成三部分。 1.構(gòu)建共表達(dá)Cyclin D1/Survivin抗凋亡CHO工程細(xì)胞株 無血清培養(yǎng)基或無蛋白培養(yǎng)基的諸多優(yōu)點(diǎn)已使之取代了有血清培養(yǎng)基而成為大規(guī)模培養(yǎng)CHO細(xì)胞的首選培養(yǎng)基。由于沒有血清提供生長因子和其它必需成分,細(xì)胞的生長增殖能力較差,而且很容易發(fā)生細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期蛋白D(Cyclin D)是一類G1期蛋白,在G1期表達(dá)持續(xù)增高,當(dāng)達(dá)到一定量時,便推動細(xì)胞周期進(jìn)入S期。所以CyclinD是細(xì)胞生長分裂的促進(jìn)蛋白。我們試圖通過過表達(dá)Cyclin D1蛋白而使細(xì)胞獲得在無血清培養(yǎng)基中高活力生長的能力。為了抑制細(xì)胞凋亡,我們在細(xì)胞中同時過表達(dá)Survivin蛋白。Survivin是一種凋亡抑制因子,屬于凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族的新成員。它包含3個內(nèi)含子和4個外顯子,表達(dá)一個分子質(zhì)量為16.3kDa的蛋白。與其他同族的IPA不同,只有一個桿狀病毒IAP重復(fù)(Baeuloviral IAP repeat,BIR)結(jié)構(gòu)域。Survivin在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化中有重要的調(diào)節(jié)作用,主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻斷細(xì)胞凋亡過程,具有很強(qiáng)的抗凋亡能力。我們應(yīng)用雙順反子表達(dá)載體pIRES在CHO DG44細(xì)胞中同時表達(dá)Survivin蛋白及Cyclin D1蛋白。應(yīng)用RT-PCR方法分別篩選到Survivin蛋白及Cyclin D1高表達(dá)克隆3個,分別為6號、13號、31號。對其進(jìn)一步做Western blot和流式細(xì)胞分析,確認(rèn)這三個細(xì)胞株分別高表Survivin蛋白及Cyclin D1蛋白。經(jīng)同步化后用流式細(xì)胞術(shù)對三株陽性細(xì)胞株和對照細(xì)胞株進(jìn)行周期測定,結(jié)果顯示改造后的細(xì)胞有更多的細(xì)胞進(jìn)入S期,用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,表明6號克隆、13號克隆及31號克隆都與對照細(xì)胞CHO DG44有顯著性差異,這證明改造后的細(xì)胞有更強(qiáng)的分裂能力。通過加入Straurosporine而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,以流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,證明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pISD的CHO DG44均具有較強(qiáng)的抗細(xì)胞凋亡能力。MTT法證明6號細(xì)胞株在不含血清的MEM培養(yǎng)基中的增殖活力顯著高于CHO DG44對照細(xì)胞。提示改造后的細(xì)胞能夠在無血清培養(yǎng)基中生長,并且具有較強(qiáng)的抗凋亡能力,具有作為生物工程宿主細(xì)胞的潛力。 2.應(yīng)用四環(huán)素調(diào)控表達(dá)Survivin基因構(gòu)建抗凋亡CHO細(xì)胞株 如今無血清培養(yǎng)基或無蛋白培養(yǎng)基已取代了有血清培養(yǎng)基而成為大規(guī)模培養(yǎng)CHO細(xì)胞的首選培養(yǎng)基。由于沒有血清提供生長因子和其它必需成分,細(xì)胞的生長增殖能力較差,而且很容易發(fā)生細(xì)胞凋亡。另外,在大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)條件時,隨著營養(yǎng)成分耗盡、有毒物質(zhì)和代謝廢物增多細(xì)胞會發(fā)生凋亡。為了抑制細(xì)胞凋亡,達(dá)到提高蛋白產(chǎn)量、質(zhì)量及延長生產(chǎn)周期的目的,將抗凋亡基因Survivin導(dǎo)入CHO,其主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻斷細(xì)胞凋亡過程具有很強(qiáng)的抗凋亡能力。為了實(shí)現(xiàn)對Survivin蛋白表達(dá)的調(diào)控,利用T-RExTM(四環(huán)素誘導(dǎo))系統(tǒng),通過兩步重組建立了穩(wěn)定整合并能調(diào)控表達(dá)Survivin基因的重組細(xì)胞株。首先通過瞬時轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(EGFP)基因篩選到高表達(dá)Tet R的重組細(xì)胞株DG44-B2,在此基礎(chǔ)上,定點(diǎn)整合受TetO2調(diào)控的Survivin基因,以實(shí)現(xiàn)對Survivin基因的調(diào)控表達(dá),并篩選高表達(dá)Survivin蛋白的重組細(xì)胞株S9、S29、S31。用200μg/ml Zeocin以及8μg/ml Blasticidin篩選穩(wěn)定克隆。用50mM NH4CI和Straurosporine進(jìn)行凋亡誘導(dǎo),然后分別用DNA Ladder法和流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測,結(jié)果表明Tet調(diào)控Survivin蛋白表達(dá)的細(xì)胞株更能對抗不利的細(xì)胞培養(yǎng)條件。 3.適于無血清培養(yǎng)的宿主細(xì)胞系CHO-TD穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建 鐵是細(xì)胞生長必須的,轉(zhuǎn)鐵蛋白是運(yùn)輸鐵離子的工具,它能夠快速傳遞細(xì)胞生長所需的鐵離子。另外,轉(zhuǎn)鐵蛋白也是一種生長因子,它能通過結(jié)合相應(yīng)受體而刺激細(xì)胞生長,是工業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)所應(yīng)用的無血清培養(yǎng)基的重要組分。我們應(yīng)用雙順反子表達(dá)載體pIRES在CHO DG44細(xì)胞中同時表達(dá)Transferrin蛋白及Cyclin D1蛋白,以期獲得能在無血清培養(yǎng)基中生長的CHO細(xì)胞株。在本實(shí)驗(yàn)中我們成功構(gòu)建了高表達(dá)Transferrin蛋白及Cyclin D1蛋白的細(xì)胞株CHO-TD。
[Abstract]:The present invention has the advantages of being capable of correctly and effectively recognizing the synthesis , processing and secretion signals of the eukaryotic protein , identifying and removing the intron in the gene , identifying and removing the intron in the gene ,


1 . Construction Co - expression of Cyclin D1 / Survivin Anti - apoptotic CHO Cell Line


The expression of Survivin and Cyclin D1 protein in CHO DG44 cells were detected by flow cytometry .


2 . Construction of Anti - apoptotic CHO Cell Lines with Survivin Gene Regulated by tetracycline


In order to improve the expression of Survivin protein and to prolong the production cycle , the recombinant cell line with high expression of Survivin protein can be regulated and regulated by means of two - step recombination .


3 . Construction of a CHO - TD Stable Strain of a Host Cell Line Suitable for Serum - free Culture


Iron is necessary for cell growth , transferrin is a tool for the transport of iron ions . It can rapidly transfer the iron ions needed for cell growth . In addition , transferrin is an important component of serum - free medium used in industrial large - scale cell culture .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 申燁華,耿信篤;CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)研究新進(jìn)展[J];生物工程進(jìn)展;2000年04期

2 吳衛(wèi)星;張毓;王小寧;詹啟敏;;國際重組蛋白藥物市場和研發(fā)趨勢的分析[J];生物技術(shù)通訊;2006年06期

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本文編號：1734836