本文選題：幽門(mén)螺桿菌 + 嗜酸乳桿菌　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】：一、研究背景和目的 幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是引起慢性胃炎和消化性潰瘍的病原菌,并與胃腺癌和胃黏膜相關(guān)B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Hp在世界人口中的感染率約為50%,在我國(guó)Hp感染率高達(dá)64%,其中發(fā)病率為約10%～20%,Hp感染大多發(fā)生于10歲以下兒童。Hp急性感染后,不易根除,在個(gè)人生活習(xí)性和社會(huì)環(huán)境影響下,極易發(fā)展為慢性胃炎和消化性潰瘍。因此,怎樣有效防治Hp感染,一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的一大難題。 目前,國(guó)內(nèi)外常用三聯(lián)藥物(如膠體鉍劑或質(zhì)子泵抑制劑+克拉霉素+甲硝唑或阿莫西林)或四聯(lián)藥物作為臨床一線療法治療Hp感染。但是,約20%患者不能得到有效根除,主要原因是Hp容易產(chǎn)生耐藥性和患者對(duì)藥物的順應(yīng)性差。如果Hp未能根除,多達(dá)75%～80%的患者很快又舊病復(fù)發(fā)。亦有學(xué)者認(rèn)為,患者口腔中存在Hp,可源源不斷地向胃內(nèi)供應(yīng)病菌,是導(dǎo)致Hp感染復(fù)發(fā)的另一重要原因。鑒于抗生素療法不甚理想,且根除療法只是感染后療法,不能預(yù)防Hp感染,因此疫苗被認(rèn)為是預(yù)防Hp感染最有效的方法,尤其是學(xué)齡前兒童進(jìn)行預(yù)防性接種,對(duì)于預(yù)防Hp感染的長(zhǎng)期效應(yīng)和減少在人群中的傳播十分重要。 幽門(mén)螺桿菌疫苗研究主要集中在蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗、全菌滅活疫苗和減毒活載體疫苗等。由于Hp主要經(jīng)黏膜途徑入侵,而蛋白質(zhì)疫苗和DNA疫苗不能誘發(fā)有效的黏膜免疫,故免疫保護(hù)效果不甚理想。全菌滅活疫苗和減毒傷寒沙門(mén)菌活載體疫苗雖可誘發(fā)有效的黏膜免疫,但存在毒性大等不良反應(yīng)。因此,迄今為止,尚無(wú)理想的疫苗應(yīng)用于臨床。 近年來(lái),乳酸菌(Lactic acid bacteria)作為載體表達(dá)和傳遞目的抗原的研究備受關(guān)注。該菌安全、無(wú)毒,被公認(rèn)為安全級(jí)微生物(GRAS, generaly recognize as safe)。乳酸菌可黏附定植于呼吸道、消化道、泌尿道等黏膜上皮細(xì)胞上,并可合成和分泌外源蛋白,誘發(fā)強(qiáng)烈的黏膜免疫應(yīng)答,因此,乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)具有傳統(tǒng)疫苗載體難以比擬的優(yōu)點(diǎn)。迄今,已在乳酸菌中表達(dá)了多種外源蛋白。例如,表達(dá)人乳頭瘤病毒16型L1抗原的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)可有效誘導(dǎo)黏膜免疫,產(chǎn)生SIgA類抗體,使陰道黏膜免受人乳頭瘤16型病毒感染；表達(dá)破傷風(fēng)痙攣毒素C片段的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),大大激發(fā)機(jī)體黏膜免疫和細(xì)胞免疫；表達(dá)肺炎鏈球菌Psp的乳酸菌(Lactic acid bacteria)經(jīng)鼻內(nèi)接種后,可激發(fā)強(qiáng)烈的黏膜IgA反應(yīng)和細(xì)胞免疫,使機(jī)體獲得抵抗致死性肺炎鏈球菌攻擊的能力；表達(dá)登革病毒衣殼蛋白(EDⅢ)的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)經(jīng)口服或鼻飼免疫小鼠后,可誘導(dǎo)黏膜免疫,保護(hù)小鼠免受感染。 本項(xiàng)研究選用嗜酸乳桿菌作為口服活疫苗的抗原投遞載體。該菌能夠與胃腸道黏膜上皮細(xì)胞緊密黏附,并可合成和分泌外源蛋白,與黏膜免疫系統(tǒng)直接接觸,誘發(fā)有效的黏膜免疫應(yīng)答,而無(wú)需大量培養(yǎng)細(xì)菌或純化目的抗原,并且以口服方式作為免疫接種途徑,對(duì)于某些人群尤其是兒童更為簡(jiǎn)便。相比乳酸乳球菌,嗜酸乳桿菌耐酸,不被膽汁所破壞,可在胃腸道內(nèi)定植。 本項(xiàng)研究選用幽門(mén)螺桿菌黏附素Hp0410作為候選抗原。黏附素在Hp黏附定植過(guò)程中起決定性作用,且定位于菌體表面,具有良好的抗原性。特異的抗黏附素SIgA類抗體能有效地抑制Hp,阻止Hp在胃與十二指腸黏膜上黏附與定植。Hp0410屬于Hp黏附素hpaA家族的基因同系物,是N-乙酰神經(jīng)氨酰乳糖結(jié)合原纖維血凝素(N-acetylneuraminyl-lactose-bindinghaemagglutinin, NLBH)的亞基,有信號(hào)肽序列,且高度保守、抗原性高,以及與其他物種蛋白的同源性低等,適于作為重要的候選抗原之一。 本項(xiàng)研究擬構(gòu)建高效、穩(wěn)定、組成型表達(dá)Hp黏附素Hp0410的嗜酸乳桿菌,免疫SPF級(jí)C57BL／6小鼠后,考察誘發(fā)小鼠產(chǎn)生特異性免疫尤其是黏膜免疫的效果；用高致病性Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1攻擊經(jīng)重組嗜酸乳桿菌免疫后小鼠,探討重組嗜酸乳桿菌拮抗Hp感染的免疫保護(hù)效果,為研制預(yù)防Hp感染的安全、有效的嗜酸乳桿菌活載體疫苗提供科學(xué)依據(jù),具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。 二、研究方法 1、按照GeneBank中幽門(mén)螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC22696的DNA序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR,從幽門(mén)螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11639染色體DNA中擴(kuò)增hp0410基因,克隆入T載體pMD19-S-T中,測(cè)序。從pMD19-S-T中切下hp0410,克隆入表達(dá)載體質(zhì)粒pMG36e中,構(gòu)建和鑒定重組質(zhì)粒pGM36e-hp0410。 2、將重組質(zhì)粒pGM36e-hp0410電轉(zhuǎn)化至嗜酸乳桿菌中,挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒,行PCR、雙酶切和DNA測(cè)序鑒定。體外大量表達(dá)后,經(jīng)SDS-PAGE電泳、硝酸銀染色和Western blot鑒定目的蛋白,并檢測(cè)重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 3、將重組嗜酸乳桿菌免疫SPF級(jí)C57BL／6小鼠后,于不同時(shí)間后處死,檢測(cè)小鼠胃黏膜SIgA類抗體和血清中特異性IgG類抗體的效價(jià),考察重組嗜酸乳桿菌誘發(fā)免疫應(yīng)答的效果。同時(shí),檢測(cè)重組嗜酸乳桿菌在小鼠體內(nèi)的存留時(shí)間。 4、選取SPF級(jí)雌性C57BL／6小鼠,灌飼NaHC03以損傷胃黏膜(利于Hp黏附定植),再以灌胃方式用高致病性Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1攻擊,建立幽門(mén)螺桿菌感染小鼠模型。4w、8w和12w后處死后,取出小鼠胃組織進(jìn)行石蠟包埋,切片后行HE染色,檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌感染及炎癥情況。 5、選取SPF級(jí)C57BL／6小鼠,先用重組嗜酸乳桿菌免疫不同時(shí)間后,再用高致病性幽門(mén)螺桿菌SS1株攻擊后處死,取胃組織,采用尿素酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、細(xì)菌分離培養(yǎng)和病理組織學(xué)檢查,考察重組嗜酸乳桿菌拮抗幽門(mén)螺桿菌感染的免疫保護(hù)效果。 三、研究結(jié)果 1、從幽門(mén)螺桿菌NCTC11639菌株基因組DNA中擴(kuò)增出Hp黏附素基因hp0410,大小約為750bp,測(cè)序結(jié)果與幽門(mén)螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株22695和J99對(duì)應(yīng)序列相比對(duì),同源性分別為95%和94%。構(gòu)建重組質(zhì)粒pMG36e-hp0410,并經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)化入嗜酸乳桿菌中,成功構(gòu)建重組嗜酸乳桿菌菌株。 2、重組嗜酸乳桿菌大量培養(yǎng)后,無(wú)需誘導(dǎo),在上清中有目的蛋白的表達(dá),分子量約為34kD。經(jīng)Western blot檢測(cè),目的蛋白可與幽門(mén)螺桿菌感染陽(yáng)性患者血清發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)。重組質(zhì)粒在紅霉素選擇壓力下穩(wěn)定性為97%,在沒(méi)有紅霉素選擇壓力下穩(wěn)定性為90%。 3、重組嗜酸乳桿菌免疫C57BL／6小鼠后,經(jīng)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),可激發(fā)小鼠胃黏膜產(chǎn)生SIgA類抗體。重組嗜酸乳桿菌在小鼠體內(nèi)的存留時(shí)間為34d。 4、以重組嗜酸乳桿菌免疫SPF級(jí)雌性C57BL／6小鼠,3w后,小鼠經(jīng)NaHC03預(yù)處理后,再以高致病性幽門(mén)螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1攻擊,4w后,從胃組織中可分離培養(yǎng)出幽門(mén)螺桿菌,但菌量明顯低于對(duì)照組,免疫后小鼠胃黏膜組織尿素酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)均為陰性；幽門(mén)螺桿菌SS1株攻擊未經(jīng)免疫的小鼠后,其胃黏膜組織的尿素酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)均為強(qiáng)陽(yáng)性；病理切片顯示經(jīng)重組嗜酸乳桿菌免疫后的小鼠胃組織炎癥病變明顯輕于未經(jīng)免疫小鼠。 四、結(jié)論 1、成功構(gòu)建了組成型穩(wěn)定表達(dá)幽門(mén)螺桿菌黏附素Hp0410的嗜酸乳桿菌重組菌株。 2、重組嗜酸乳桿菌免疫小鼠后,可誘生黏膜SIgA類抗體,有效拮抗幽門(mén)螺桿菌的感染。
[Abstract]:I . Background and purpose of research

Helicobacter pylori ( Hp ) is a pathogenic bacterium causing chronic gastritis and peptic ulcer , and is closely related to gastric adenocarcinoma and gastric mucosa - associated B - cell lymphoma . Hp infection rate is about 50 % in the world population . In China , Hp infection rate is about 50 % . In China , the infection rate is about 10 % ~ 20 % . Hp infection mostly occurs in children under 10 years old . Hp infection is very easy to develop into chronic gastritis and peptic ulcer .

Hp infection can not be prevented by Hp infection in the oral cavity of the patient , and the eradication therapy is only a post - infection therapy , which is another important reason for the recurrence of Hp infection .

Helicobacter pylori vaccine research mainly focuses on protein vaccines , DNA vaccines , whole - bacteria inactivated vaccines and attenuated live vector vaccines . Since Hp is mainly invaded by mucosal route , and protein vaccines and DNA vaccines cannot induce effective mucosal immunity , the immune protective effect is not ideal .

In recent years , lactic acid bacteria ( lactic acid bacteria ) have attracted much attention as a carrier expression and transfer target antigen . The bacterium is safe and non - toxic , and is widely recognized as safe class microorganism ( GRAS , generaly , as safe ) . The lactic acid bacteria can be adhered to mucous membrane epithelial cells such as respiratory tract , digestive tract , urinary tract and the like , and can synthesize and secrete exogenous protein , induce strong mucosal immune response , and thus , the lactic acid bacteria expression system has the advantages of difficult comparison with the traditional vaccine carrier .
Lactococcus lactis expressing tetanus toxin C fragment greatly stimulates mucosal immunity and cellular immunity ;
After intranasal inoculation , the lactic acid bacteria expressing Streptococcus pneumoniae Psp can stimulate strong mucosal IgA response and cellular immunity , so that the organism has the ability to resist the attack of S . pneumoniae ;
Lactococcus lactis expressing dengue virus capsid protein ( ED 鈪，

本文編號(hào)：1731346