本文選題：結(jié)核分枝桿菌　切入點：rmlB基因　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病,主要的原因是耐多藥的結(jié)核分枝桿菌菌株的增加,而現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物不能有效的治愈結(jié)核病,所以每年有900萬的新增病例,300萬人死亡。研究新一代的抗結(jié)核藥物迫在眉睫。 細(xì)胞壁是分枝桿菌賴以生存的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),所以結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁可以作為新藥研發(fā)的靶標(biāo)。其核心結(jié)構(gòu)由肽聚糖,聚阿拉伯糖半乳糖和分枝菌酸組成,其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖通過銜接雙糖L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺共價連接到肽聚糖分子上,如果破壞了銜接雙糖的結(jié)構(gòu),就會破壞結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁,導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。由于人體中不存在鼠李糖分子,因此鼠李糖可以作為研發(fā)新一代抗結(jié)核藥物的重要靶點。結(jié)核分枝桿菌基因組中rmlA-D四種基因編碼了RmlA-D四種酶,參與了由底物1-磷酸葡萄糖合成dTDP-L-鼠李糖的過程。所以RmlA-D四種酶的任一種酶都可作為開發(fā)抗結(jié)核新藥的靶標(biāo)。 結(jié)核分枝桿菌RmlB即dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫氫酶是dTDP-L-鼠李糖合成過程中第二步反應(yīng)所需的酶。為了深入研究RmlB的活性,我們首先要克隆編碼這種酶的rmlB基因,然后利用大腸桿菌高效表達(dá)RmlB蛋白質(zhì),為進(jìn)一步研究RmlB酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)及建立篩選抗結(jié)核藥物的酶反應(yīng)體系提供物質(zhì)保障。 本論文的目的是:(1)用PCR法從結(jié)核分枝桿菌基因組DNA中擴增Tb rmlB基因;(2)將Tb rmlB基因克隆到pMD18-T的克隆載體中,并對DNA序列進(jìn)行測定;(3)將Tb rmlB基因亞克隆到pET29b表達(dá)載體中并通過改變不同的誘導(dǎo)條件在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)RmlB蛋白質(zhì);(4)用親和層析法純化重組RmlB蛋白質(zhì),并用Western Blotting方法鑒定RmlB蛋白質(zhì);(5)建立測定RmlB酶的活性;(6)確定RmlB酶的最佳反應(yīng)條件并測定RmlB酶的反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)。 本論文所獲得的結(jié)果如下: 1.用PCR方法對目的基因Tb rmlB的擴增 從結(jié)核分枝桿菌H37R菌株基因組數(shù)據(jù)庫(http://genolist.pasteur.f -r./TubercuList/)中獲得Tb rmlB基因的核苷酸序列(996 bp)。根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計一對PCR引物,并在上游引物和下游引物的5’端分別引入Nde I和Xho I限制性內(nèi)切酶位點。以便將Tb rmlB基因克隆到pET29b表達(dá)載體的Nde I和Xho I位點。用具高保真的primer STARTMHS聚合酶,以H37Rv菌株基因組DNA為模板成功擴增了Tb rmlB基因。 2. pMD18-Tb rmlB的構(gòu)建及核苷酸序列測定 將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌NovaBlue菌株的感受態(tài)細(xì)胞中。用限制性內(nèi)切酶酶切的方法鑒定陽性重組質(zhì)粒。對pMD18-Tb rmlB中的Tb rmlB基因進(jìn)行DNA序列測定,對DNA測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析,將所測得的核苷酸序列與Tb rmlB基因進(jìn)行序列比對,發(fā)現(xiàn)在798 bp處由G變?yōu)門,但氨基酸序列未發(fā)生任何改變,表明在本實驗中利用PCR方法獲得的Tb rmlB為正確的基因,理論上能夠正確表達(dá)出Tb RmlB蛋白。 3.表達(dá)載體pET29b-Tb rmlB的構(gòu)建 用Nde I和Xho I雙酶切pMD18-Tb rmlB質(zhì)粒,回收和純化rmlB基因,將其連接到pET29b表達(dá)載體的Nde I和Xho I位點,構(gòu)建pET29b-Tb rmlB表達(dá)質(zhì)粒。用Nde I和Xho I雙酶切的方法鑒定陽性重組質(zhì)粒。RmlB蛋白的C端與質(zhì)粒上的組氨酸標(biāo)簽形成融合蛋白。 4. Tb RmlB蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)和純化 將pET29b-Tb rmlB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,加入IPTG ,使其終濃度達(dá)到0.5 mM , 15℃振蕩培養(yǎng)過夜。誘導(dǎo)攜帶pET29b-Tb rmlB質(zhì)粒的BL21(DE3)表達(dá)重組蛋白。用超聲方法破碎誘導(dǎo)后的BL21(DE3),對上清和沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析,結(jié)果表明RmlB蛋白在BL21(DE3)中可溶性表達(dá)。 采用組氨酸-Ni~(2+)親和層析技術(shù)純化RmlB蛋白,對純化的蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)定量(考馬斯亮藍(lán)法),第1 ml RmlB蛋白的濃度為1.533 mg/ml。SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果表明RmlB蛋白的純度高。 5.建立測定RmlB酶活性的方法 將反應(yīng)底物dTDP-Glucose和NAD~+與純化的RmlB酶蛋白在30℃反應(yīng)30分鐘,用1 M NaOH終止反應(yīng),然后利用754分光光度計檢測340 nm處的吸光度值,吸光度值明顯增加表明有產(chǎn)物的生成,純化的RmlB蛋白質(zhì)具有酶活性。 6.確定RmlB酶的最佳反應(yīng)條件 分別改變反應(yīng)的溫度和反應(yīng)的pH值,利用754分光光度計檢測340 nm處的吸光度值的增加反應(yīng)產(chǎn)物的生成量。結(jié)果表明RmlB酶蛋白的最適反應(yīng)溫度是30℃,最適pH值是7.5。 7.測定RmlB酶的反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)。 采用最佳的酶反應(yīng)條件,即30℃,pH值是7.5,酶濃度是0.05 mg/ml,反應(yīng)時間是30分鐘。分別用不同的底物濃度,進(jìn)行酶促反應(yīng),然后用1 M NaOH終止反應(yīng)。利用754分光光度計檢測340 nm處的吸光度值反應(yīng)產(chǎn)物的生成量。用雙倒數(shù)作圖法得出RmlB的Km值和Vmax。對于底物dTDP-Glucose, Km = 3.965 mmol/L, Vmax = 4.2513 mmol/(L.min)。 結(jié)論: 在本研究中,我們構(gòu)建了pET29b-Tb rmlB表達(dá)載體,在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)出大量的可溶性RmlB蛋白。用純化的蛋白研究酶的活性,確定了RmlB的最佳反應(yīng)條件并測定了RmlB酶蛋白的反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km和Vmax。為建立完善的篩選抗結(jié)核藥物的酶反應(yīng)體系奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis is an infectious disease which is seriously harmful to human health , mainly because of the increase of mycobacterium tuberculosis strain , and the existing anti - tuberculosis drugs cannot cure tuberculosis effectively , so there are 9 million new cases and 3 million deaths each year . It is urgent to study the new generation of anti - tuberculosis drugs .


The cell wall of Mycobacterium tuberculosis can be used as a target for research and development of new drug . The core structure of mycobacterium tuberculosis is composed of peptidoglycan , polyarabinose galactose and mycolic acid , wherein the mycolic acid and the polyarabinose galactose are covalently linked to the peptidoglycan molecule through the linking disaccharide L - rhamnoside - D - N - acetylglucosamine , and the RmlA - D four genes encode the RmlA - D four enzymes and participate in the process of synthesizing dtdp - L - rhamnoside by the substrate 1 - phosphate . Therefore , any of the four enzymes of RmlA - D can be used as a target for developing anti - tuberculosis drugs .


In order to study the activity of RmlB , we first cloned the rmlB gene encoding this enzyme , then expressed the RmlB protein efficiently by using E . coli .


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本文編號：1720209