本文選題：A類清道夫受體　切入點：fucoidan　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】：目的: 關(guān)于A類清道夫受體(scavenger receptor A, SR-A)在巨噬細胞凋亡中的作用現(xiàn)今尚無一致意見。本課題應(yīng)用SR-A的配體巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan)作為工具藥,深入研究了SR-A對于巨噬細胞凋亡的影響、作用機制和下游信號通路,旨在闡明fucoidan在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡中所起的作用及其分子機制,為阻止巨噬細胞凋亡、防治動脈粥樣硬化斑塊進展提供新的途徑。 方法: 本研究首先用SR-A敲除和野生型的小鼠腹腔巨噬細胞復(fù)制ER stress,在此基礎(chǔ)上觀察給予或不給予fucoidan對細胞凋亡的影響,細胞凋亡用Annexin V/PI染色和PI染色流式檢測法進行檢測。接著分別用毒胡蘿卜素(TG)或乙酰化LDL加�；o酶A:膽固醇�；D(zhuǎn)移酶的抑制劑58035(造成細胞游離膽固醇蓄積,FC loading)處理小鼠RAW264.7巨噬細胞,使之產(chǎn)生ER stress,觀察細胞的凋亡情況以及給予fucoidan后細胞凋亡率的改變,同時用MTT法檢測細胞活性的變化情況。有關(guān)fucoidan對巨噬細胞凋亡影響的作用機制研究主要依靠Western blot檢測法來進行。首先觀察fucoidan作用引起的細胞ERK1/2信號分子磷酸化活性的改變,并利用SR-A敲除和野生型小鼠腹腔巨噬細胞確定其作用是否通過SR-A發(fā)揮。接著運用ERK1/2的阻斷劑PD98059,觀察當(dāng)ERK1/2磷酸化活性被抑制后,fucoidan對ER stress誘導(dǎo)凋亡的抑制作用是否仍存在,確認(rèn)ERK1/2的磷酸化激活在fucoidan抑制ER stress誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡中所起的作用。 結(jié)果: 用TG處理小鼠腹腔巨噬細胞可引起ER stress,Annexin V/PI染色實驗結(jié)果提示,同時還發(fā)生了細胞凋亡,在處理后12 h即出現(xiàn)較高比例晚期凋亡細胞(Annexin V和PI染色均呈陽性),在SR-A敲除和野生型的巨噬細胞中無明顯差異。如果在誘導(dǎo)ER stress同時加入fucoidan共孵育,則可明顯降低晚期凋亡率,凋亡細胞多呈現(xiàn)早期凋亡狀態(tài)(Annexin V染色陽性,PI染色陰性)。這種現(xiàn)象僅見于SR-A野生型巨噬細胞,而在SR-A-/-巨噬細胞中,細胞早晚期凋亡率與ER stress組相比無明顯差異。PI染色流式檢測細胞凋亡的結(jié)果與Annexin V染色的結(jié)果相一致,提示fucoidan可能通過SR-A發(fā)揮抑制ER stress誘導(dǎo)的巨噬細胞晚期凋亡的作用。 用小鼠RAW264.7巨噬細胞系進行重復(fù)實驗,發(fā)現(xiàn)用TG或FC loading誘導(dǎo)的細胞凋亡均可被fucoidan所抑制,細胞凋亡被抑制率分別可達到86%和90%左右,MTT結(jié)果顯示fucoidan甚至能部分恢復(fù)細胞活性,可以使TG或FC loading導(dǎo)致的細胞生長抑制分別減少約19%和15%。 進一步研究fucoidan的細胞活性保護機制,發(fā)現(xiàn)fucoidan處理細胞可以激活MAPK家族的數(shù)種主要信號分子的磷酸化活性,尤其能長時間持續(xù)激活ERK1/2磷酸化活性。當(dāng)敲除SR-A基因后,fucoidan喪失對ERK1/2磷酸化的激活作用。用ERK1/2磷酸化活性抑制劑PD98059進行實驗,發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制ERK1/2的磷酸化活性后,fucoidan對ER stress所誘導(dǎo)的細胞凋亡的抑制作用也消失,其拮抗ER stress所起的細胞活性保護作用也終止,提示fucoidan抑制巨噬細胞凋亡、保護細胞活性的作用可能由ERK1/2信號分子所介導(dǎo)。 結(jié)論: 作為A類清道夫受體的配體,fucoidan與SR-A結(jié)合以后,通過激活ERK1/2的磷酸化活性,抑制了由ER stress所誘導(dǎo)的巨噬細胞的晚期凋亡,提高細胞活性。
[Abstract]:Purpose :

The effect of SR - A on the apoptosis of macrophages , the mechanism of action and the downstream signaling pathway were studied . The purpose of this study was to clarify the role and molecular mechanism of SR - A in macrophage apoptosis induced by ER stress , and to provide a new approach to prevent the apoptosis of macrophages and prevent the progression of atherosclerotic plaque .

Method :

In this study , we first observed the effect of the inhibition on apoptosis of mouse RAW264.7 macrophages by using SR - A knock - out and wild - type mouse peritoneal macrophages .

Results :

At the same time , apoptosis was observed in mice peritoneal macrophages treated with TG , and apoptosis was observed . At 12 h after treatment , there was no significant difference in apoptosis cells ( both annexin V and PI staining ) . This phenomenon was found only in SR - A wild type macrophages , whereas in SR - A - / - macrophages , the early and late apoptotic rate of the cells was not significantly different from that of ER stress group . The results of PI staining flow cytometry showed that SR - A could play a role in inhibiting the late apoptosis of macrophages induced by ER stress .

The inhibition rate of cell apoptosis induced by TG or FC loading could be up to 86 % and 90 % respectively . The results showed that the cell growth inhibition induced by TG or FC loading could be reduced by about 19 % and 15 % , respectively .

Further research on the mechanism of cell activity protection of the MAPK family has been investigated . It is found that the phosphorylation activity of the MAPK family can be activated for a long period of time , especially for a long period of time . When the phosphorylation activity of ERK 1 / 2 is inhibited , the inhibitory effect of the phosphorylation of ERK 1 / 2 on the phosphorylation of ERK 1 / 2 is also eliminated . The effect of the inhibition of ER stress on the apoptosis of the cells is also terminated . It is suggested that the effect of the inhibitory effect on the apoptosis of macrophages and the protection of cell activity may be mediated by the 1 / 2 signal molecule .

Conclusion :

As a ligand for the class A scavenger receptor , after binding with SR - A , the late apoptosis of macrophages induced by ER stress is inhibited and cell activity is increased by activating the phosphorylation activity of 1 / 2 .

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R363

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本文編號：1712163