本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：生物學(xué)特性　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cell,BMSCs)具有極強(qiáng)的自我復(fù)制和多向分化潛能,來(lái)源廣泛,易于獲取并且具有低免疫源性,可將BMSCs用于細(xì)胞移植治療,具有非常重要的理論研究意義和臨床價(jià)值。近年來(lái)的研究提示,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞,這一現(xiàn)象為臨床上應(yīng)用BMSCs移植治療肝損傷和急慢性肝功能衰竭展示了一個(gè)可喜的前景。現(xiàn)已證實(shí),在體外培養(yǎng)條件下BMSCs可由肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)等細(xì)胞因子誘導(dǎo)向肝細(xì)胞分化,并可釋放多種肝細(xì)胞因子,但對(duì)BMSCs體內(nèi)移植后能否向具肝細(xì)胞功能的細(xì)胞分化并對(duì)受損肝臟起修復(fù)作用的研究則鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,本課題將大鼠骨髓中分離獲得的BMSCs在體外純化、擴(kuò)增后通過(guò)門靜脈移植入肝損傷大鼠體內(nèi),觀察BMSCs移植后在肝臟內(nèi)的分布及受損肝臟修復(fù)情況,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與簽定 目的建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離和培養(yǎng)擴(kuò)增的方法,同時(shí)對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究,為BMSCs作為種子細(xì)胞治療臨床疾病提供理論依據(jù)。 方法聯(lián)合應(yīng)用密度梯度離心法和貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行分離獲取大鼠BMSCs,應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)記物來(lái)鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為BMSCs;在倒置顯微鏡下觀察BMSCs的形態(tài)學(xué)特點(diǎn),細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定BMSCs接種貼壁率,并繪制出生長(zhǎng)曲線。 結(jié)果通過(guò)聯(lián)合密度梯度離心法與貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)出的BMSCs純度高。BMSCs體外培養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛,具有活躍的增殖能力。培養(yǎng)的BMSCs陽(yáng)性表達(dá)CD29、CD44,陰性表達(dá)CD34、CD45。 結(jié)論通過(guò)聯(lián)合密度梯度離心與貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法能從骨髓中獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;獲得的BMSCs在體外生長(zhǎng)穩(wěn)定,且增殖較快,可作為組織工程的種子細(xì)胞。 第二部分慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究 目的對(duì)分離、培養(yǎng)到第三代的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染,觀察其轉(zhuǎn)染效率及對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響,為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因治療研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法利用密度梯度離心、貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。利用脂質(zhì)體法進(jìn)行慢病毒感染大鼠BMSCs。 結(jié)果體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)攜帶綠色熒光蛋白(greenfluorescence protein,GFP)的慢病毒轉(zhuǎn)染72h后可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá),96h后達(dá)到高峰。轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外繼續(xù)培養(yǎng),1月后仍可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá),但表達(dá)強(qiáng)度較前減弱。在一定病毒復(fù)數(shù)范圍內(nèi),慢病毒對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率隨病毒復(fù)數(shù)的增加而增高,當(dāng)病毒復(fù)數(shù)為5時(shí),轉(zhuǎn)染率達(dá)到80%以上;但病毒復(fù)數(shù)超出一定范圍后,轉(zhuǎn)染率反而下降。慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和未轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線未見(jiàn)明顯變化。 結(jié)論慢病毒對(duì)大鼠BMSCs有較高的轉(zhuǎn)染率,且攜帶的GFP能在BMSCs內(nèi)有效表達(dá),可以作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因治療的載體和體內(nèi)示蹤。 第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)肝功能影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的觀察同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在肝臟特定微環(huán)境下是否向具肝細(xì)胞功能的細(xì)胞分化并探討其對(duì)大鼠受損肝臟修復(fù)作用的可行性。 方法利用密度梯度離心、貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后的第3代BMSCs從門靜脈植入肝大部分切除大鼠體內(nèi),分別于移植后7、14、28d行血清肝功能檢測(cè),分析BMSCs對(duì)肝功能的作用。移植后的第28d取出肝臟,通過(guò)冰凍切片熒光檢測(cè),觀察BMSCs在大鼠肝臟內(nèi)定居分布情況。 結(jié)果大鼠連續(xù)用2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene,2-AAF)灌喂6d后出現(xiàn)精神萎靡、厭食、少活動(dòng)、尿深黃;肉眼見(jiàn)肝臟明顯充血腫大、邊緣圓鈍、表面可見(jiàn)針尖樣細(xì)小顆粒、呈局灶性,偶見(jiàn)有小出血點(diǎn);HE見(jiàn)部分肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松。術(shù)后BMSCs移植組和DMEM/F12注射組各肝功能檢測(cè)指標(biāo)均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸恢復(fù);BMSCs移植組與DMEM/F12注射組比較,ALB、ALT和AST均有顯著性差異(P＜0.05)。術(shù)后28d,BMSCs移植組與正常組比較,ALB、ALT、AST、ALP均無(wú)顯著性差異(P＞0.05);DMEM/F12注射與正常組比較,ALB、ALT均有顯著性差異(P＜0.05)。這些表明BMSCs移植對(duì)肝功能的恢復(fù)有促進(jìn)作用。術(shù)后冰凍切片,BMSCs移植組可見(jiàn)BMSCs定居于肝臟內(nèi),主要在匯管區(qū)周圍,肝實(shí)質(zhì)里也可見(jiàn)散在分布,而心、肺、脾、腎未見(jiàn)BMSCs。HE染色BMSCs移植組肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝索排列規(guī)則;DMEM/F12注射組仍見(jiàn)部分肝索排列紊亂,肝竇增寬或變窄、消失。 結(jié)論經(jīng)門靜脈移植的BMSCs能在受損肝臟內(nèi)定居、增殖,BMSCs移植可以在一定程度上修復(fù)受損肝臟。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)研究,掌握了BMSCs的分離與培養(yǎng)的方法,證實(shí)了BMSCs具有干細(xì)胞極強(qiáng)的自我復(fù)制和多向分化潛能的生物學(xué)特性;成功應(yīng)用攜帶GFP的慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染BMSCs,且GFP高效、穩(wěn)定表達(dá),為進(jìn)一步攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs用于基因治療提供理論依據(jù);慢病毒轉(zhuǎn)染后的BMSCs經(jīng)門靜脈移植后能定居于肝臟內(nèi),并可以在一定程度上修復(fù)受損肝臟,證實(shí)了BMSCs在肝臟特定微環(huán)境下對(duì)受損肝臟起修復(fù)作用。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 張強(qiáng),李京雨,徐力揚(yáng),劉明,姚鵬,王帥;經(jīng)肝動(dòng)脈骨髓干細(xì)胞移植治療肝硬化的初步臨床應(yīng)用[J];中國(guó)介入影像與治療學(xué);2005年04期

2 張剛慶,方馳華,池達(dá)智;共同培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的研究[J];中華肝臟病雜志;2005年09期

3 姚鵬,胡大榮,王帥,聞煒,周一鳴,龔麗娟;自體骨髓干細(xì)胞移植治療慢性肝衰竭研究[J];肝臟;2005年03期

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本文編號(hào)：1707832