本文選題：銅綠假單胞菌　切入點(diǎn)：綠原酸　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.a)是一種常見的條件致病菌,是引起免疫力低下患者的慢性感染的常見病原體,該菌對多種常見抗生素耐藥,感染易反復(fù)發(fā)作,難以清除。與其慢性感染密切相關(guān)的是P.a可以形成生物膜(biofilm,BF),并能分泌多種毒力因子(virulence factors)。BF的形成和維持、毒力因子的合成釋放主要由密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing, QS)調(diào)控。我課題組經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)研究證明金銀花水煎液可抑制P.a的BF形成,并對已形成的P.a的BF有明顯的破壞作用[58];金銀花的主要活性成分為綠原酸(Chlorogenic acid, CA)。因此,本研究采用體外BF模型的方法,探討亞抑菌濃度的CA對P.a的BF形成的抑制作用;然后研究亞抑菌濃度的CA對P.a毒力因子(藻酸鹽、彈性蛋白酶、蛋白水解酶、過氧化物酶、綠膿菌素、鼠李糖脂)釋放的抑制作用;進(jìn)而采用質(zhì)譜方法檢測亞抑菌濃度的CA對P.a的QS系統(tǒng)信號分子的影響,探討其干預(yù)P.a生物膜和毒力因子的分子機(jī)制;再以大鼠腹腔感染模型為基礎(chǔ),研究QS系統(tǒng)在體內(nèi)BF感染中的作用,以及CA對體內(nèi)P.a的BF的抑制作用。 第一部分綠原酸對銅綠假單胞菌生物膜的抑制作用及其機(jī)制的體外研究 第一節(jié)綠原酸對銅綠假單胞菌體外生物膜形成的抑制作用 目的:觀察CA對P.a體外BF形成的抑制作用。 方法:(1)檢測CA、紅霉素(erythromycin,EM)對PAO1的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)。(2)采用體外靜置BF模型,分為空白對照組、EM組和CA組。開始建模時(shí)就加入EM(1/8MIC)和CA(1/4MIC)。建模第3天和第7天,采用SEM觀察載體表面BF形態(tài)、結(jié)晶紫染色法半定量載體表面BF。 結(jié)果:(1)CA對P.a的MIC是3000ug/ml,EM對P.a的MIC是128ug/ml。(2)建模3天,SEM觀察,空白對照組載體表面可形成早期BF,CA組和EM組載體表面形成的BF規(guī)模明顯小于空白對照組;建模7天,空白對照組載體表面可見濃厚黏液樣物質(zhì), BF呈立體結(jié)構(gòu),而CA組和EM組僅見薄層BF。不論是建模3天,還是建模7天,結(jié)晶紫染色法BF半定量,CA組不僅少于空白對照組(P0.01),而且少于EM組(P0.05)。 結(jié)論:CA可抑制P.a體外BF的形成,且其抑制作用強(qiáng)于EM。 第二節(jié)綠原酸對銅綠假單胞菌毒力因子的抑制作用 目的:觀察CA對P.a毒力因子的抑制作用。 方法:(1)建立體外靜置BF模型,分為空白對照組、EM組和CA組,加入EM(1/8MIC)和CA(1/4MIC)。(2)檢測培養(yǎng)液藻酸鹽含量;彈性蛋白-剛果紅法測定菌液中彈性蛋白酶活性;偶氮酪蛋白法測定建模3、7天的菌液中蛋白水解酶活性;氯仿萃取法測定建模1、3、5、7天菌液的綠膿菌素的相對濃度;測定CA作用后游離菌及BF細(xì)菌對H2O2的敏感性;苔黑酚—濃硫酸法測定EM、CA作用后,菌液的鼠李糖脂含量。 結(jié)果:(1)培養(yǎng)液中藻酸鹽含量檢測,CA組不僅少于空白對照組(P0.01),而且少于EM組(P0.05)。(2)與空白對照組相比,EM組、CA組的彈性蛋白酶活性明顯較低(P0.01),而CA組彈性蛋白酶活性與EM組相當(dāng)(P0.05)。(3)無論是3天,還是7天,與空白對照組相比,EM組、CA組的蛋白水解酶活性明顯較低(P0.01),但是CA組高于EM組(P0.05)。(4)在BF形成的各個(gè)時(shí)期,菌液綠膿菌素相對濃度測定,EM組和CA組綠膿菌素相對濃度均低于空白對照組(P0.01),CA組綠膿菌素相對濃度高于EM組(P0.05);(5)在進(jìn)入對數(shù)生長期(4-6h)前, CA組游離P.a與空白組對H2O2敏感性相當(dāng)(P0.05),進(jìn)入對數(shù)生長期后,CA組銅綠假單胞菌對H2O2敏感性強(qiáng)于PAO1空白組(P0.05);3天和7天的H2O2敏感性測定, EM組和CA組均高于空白對照組(P0.05)。早期生物膜細(xì)菌CA組對H2O2敏感性高于EM組(P0.05),而成熟期,CA組對H2O2敏感性則低于EM組(P0.05)。(6)在作用后48h或72h, EM組及CA組的鼠李糖脂均少于空白對照組(P0.01),作用48h時(shí)CA組鼠李糖脂含量高于EM組(P0.05),作用72h時(shí)CA組鼠李糖脂含量與EM組相當(dāng)(P0.05)。 結(jié)論:CA可以抑制P.a的多種毒力因子的釋放,對蛋白水解酶活性、各時(shí)期綠膿菌素,48h鼠李糖脂及成熟期的氧化應(yīng)激的抑制作用弱于EM;對彈性蛋白酶活性及72h鼠李糖脂抑制作用與EM相當(dāng);但對藻酸鹽和早期生物膜細(xì)菌的氧化應(yīng)激的抑制作用高于EM組。 第三節(jié)綠原酸對銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)信號分子的抑制作用 目的:探討CA對P.a QS系統(tǒng)信號分子的抑制作用。 方法:(1)乙酸乙酯萃取法提取EM,CA作用后菌液的信號分子。(2)HPLC MS鑒定PAO1產(chǎn)生的AHLs信號分子的種類,并檢測其信號分子3-oxo-C12-HSL,C4-HSL的含量。 結(jié)果:(1)PAO1產(chǎn)生的AHLs信號分子中3-oxo-C12-HSL和C4-HSL含量最高,且在胞外中,C4-HSL的含量高于3-oxo-C12-HSL(P0.05)。(2)EM組和CA組的C4-HSL, 3-oxo-C12-HSL含量都明顯少于空白對照組(P0.05),CA對3-oxo-C12-HSL的抑制作用弱于EM(P0.05), EM組和CA組中,C4-HSL含量無差別(P0.05)。 結(jié)論:PAO1產(chǎn)生的AHLs信號分子主要是3-oxo-C12-HSL和C4-HSL;胞外AHLs信號分子中,C4-HSL含量高于3-oxo-C12-HSL;CA可以抑制QS系統(tǒng)AHLs信號分子的產(chǎn)生,其對3-oxo-C12-HSL的抑制作用比EM弱,而對于C4-HSL,二者效應(yīng)一致。 第二部分綠原酸對銅綠假單胞菌生物膜的抑制作用的體內(nèi)研究 第一節(jié)QS系統(tǒng)在銅綠假單胞菌體內(nèi)生物膜形成中的作用 目的:構(gòu)建大鼠腹腔P.a BF感染模型,初步探討QS系統(tǒng)在BF形成中的作用。 方法:(1)體外準(zhǔn)備:以PVC導(dǎo)管為載體,銅綠假單胞菌PAO1野生株和PAO1 ?lasR rhlR缺陷株(PA-JP3)在體外培養(yǎng)20h,使其在黏附在載體表面。(2)構(gòu)建大鼠腹腔P.a BF感染模型: 48只Wistar大鼠,隨機(jī)分為PAO1組和PA-JP3組,將上述載體植入Wistar大鼠腹腔,建立P.a BF感染模型。建模后分別在第3天,7天和第14天,病理學(xué)觀察腹腔局部組織炎癥變化,SEM觀察載體表面BF變化,連續(xù)稀釋法載體表面菌落計(jì)數(shù)。 結(jié)果:PAO1組腹腔局部組織炎癥反應(yīng)明顯較PA-JP3組嚴(yán)重。第3天、第7天和第14天SEM觀察,載體表面細(xì)菌粘附量均較PA-JP3組多,形成的BF多且稠厚;載體表面菌落計(jì)數(shù)明顯高于PA-JP3組(P0.05);與PA-JP3組相比,機(jī)體對PAO1組載體細(xì)菌清除緩慢,在第7天后有增多趨勢(P0.05)。 結(jié)論:PVC材料可以在大鼠腹膜腔成功構(gòu)建PAO1體內(nèi)BF模型; QS系統(tǒng)在體內(nèi)BF形成中起重要作用。 第二節(jié)綠原酸對銅綠假單胞菌體內(nèi)生物膜形成的抑制作用 目的:探討CA對P.a體內(nèi)BF形成的抑制作用。 方法:以銅綠假單胞菌PAO1野生株為實(shí)驗(yàn)菌株,32只大鼠隨機(jī)分為對照組和CA組,建立腹腔感染模型后,腹腔注射CA溶液40mg/kg·d,每12小時(shí)一次,移植物置入后就開始腹腔注射,連續(xù)用3d、7d。對照組用等量的無菌生理鹽水腹腔注射。建模后分別在第3天和第7天,病理學(xué)觀察腹腔局部組織炎癥變化,SEM觀察載體表面BF變化,連續(xù)稀釋法載體表面菌落計(jì)數(shù)。 結(jié)果:CA干預(yù)后,PAO1野生株組SEM觀察載體表面細(xì)菌粘附數(shù)量較對照組明顯減少,BF少而且稀薄,局部組織炎癥反應(yīng)明顯較生理鹽水對照組明顯減輕,第3天和第7天載體表面菌落計(jì)數(shù)均明顯少于對照組(P0.05)。 結(jié)論:CA可以抑制P.a體內(nèi)BF的形成。
[Abstract]:Pseudomonas aeruginosa ( P . a ) is a common pathogen , which is a common pathogen of chronic infection in patients with low immunity , which is resistant to many common antibiotics and is difficult to remove . It is closely related to chronic infection that P.a can form biofilm ( BF ) and secrete various virulence factors . The formation and maintenance of BF , the release of virulence factors were mainly regulated by density sensing system ( QS ) . In this study , the inhibitory effect of CA on P . a ' s BF formation was studied by means of an in vitro BF model . The effect of CA on P . a virulence factor ( alginate , elastase , proteolytic enzyme , peroxidase , pseudomonas aeruginosa , rhamnolipid ) was studied by mass spectrometry .



Inhibitory effect of chlorogenic acid on Pseudomonas aeruginosa biofilm and its mechanism in vitro



Inhibitory effect of chlorogenic acid on biofilm formation in vitro of Pseudomonas aeruginosa



Objective : To observe the inhibitory effect of CA on P . a in vitro BF formation .



Methods : ( 1 ) The minimal inhibitory concentration ( MIC ) of CA and erythromycin ( EM ) on PAO1 was detected .



Results : ( 1 ) The MIC of CA to P.a was 3000ug / ml , the MIC of EM to P.a was 128ug / ml . ( 2 ) The size of BF formed on the surface of blank control group was obviously smaller than that of blank control group .



Conclusion : CA can inhibit the formation of P . a in vitro BF and its inhibitory effect is stronger than EM .



The Inhibitory Effect of Section Two Chlorogenic Acid on Virulent Factors of Pseudomonas aeruginosa



Objective : To observe the inhibitory effect of CA on P . a virulence factor .



Methods : ( 1 ) To establish an in vitro static BF model , which was divided into blank control group , EM group and CA group . EM ( 1 / 8MIC ) and CA ( 1 / 4MIC ) were added . ( 2 ) The activity of elastase was determined by the method of chloroform extraction . The sensitivity of free bacteria and BF bacteria to H2O2 was determined by chloroform extraction method .



Results : ( 1 ) The concentration of H2O2 in CA group was significantly lower than that in the control group ( P0.05 ) . The concentration of H2O2 in CA group was significantly lower than that in EM group ( P0.05 ) .



Conclusion : CA can inhibit the release of various virulence factors of P . a , inhibit the activity of proteolytic enzyme , inhibit the activity of pyocyanin in each period , and inhibit the oxidative stress of rhamnolipid and mature period in the mature period . The inhibitory effect of CA on the activity of elastase and the activity of LPS in 72h is comparable to EM ; however , the inhibition of oxidative stress on alginate and early biofilm bacteria is higher than EM group .



Inhibitory effect of chlorogenic acid on signal molecule in Pseudomonas aeruginosa QS system



Objective : To investigate the inhibitory effect of CA on signal molecules in P.a QS system .



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本文編號：1703817