本文選題：日本血吸蟲　切入點：激光共聚焦顯微鏡　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 血吸蟲病是嚴(yán)重危害人民身體健康,阻礙社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大傳染病。日本血吸蟲致病主要是由于蟲卵在肝臟大量沉積形成的蟲卵肉芽腫及其纖維化�？刂蒲x性別分化、性成熟及雌蟲產(chǎn)卵成為防治血吸蟲病的重要策略之一。 Mago nashi基因(Genebank登錄號BM735619)所編碼的蛋白通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)在人,果蠅,線蟲等絕大多數(shù)生物中至少有80%的同源性。已有報道該基因在正常情況下抑制雄性化基因的表達(dá),是決定生殖細(xì)胞雄性化作用的基因。由此推測日本血吸蟲Mago nashi基因在血吸蟲的生殖系統(tǒng)中也起著較為重要的作用。為了解日本血吸蟲Mago nashi蛋白的功能,我們首先通過激光共聚焦顯微鏡觀察日本血吸蟲在終宿主體內(nèi)不同發(fā)育階段的形態(tài)特征,然后用RNAi技術(shù)下調(diào)Mago nashi基因的轉(zhuǎn)錄水平,再觀察干擾作用后蟲體的發(fā)育(尤其是生殖系統(tǒng)發(fā)育)是否與正常蟲體之間存在差異。 日本血吸蟲于終宿主體內(nèi)的發(fā)育是一個復(fù)雜的過程,由適應(yīng)自然外界生存過渡到適應(yīng)終宿主體內(nèi)生存,其生理、形態(tài)等方面發(fā)生了巨大變化。而這些變化對于我們研究日本血吸蟲病的預(yù)防以及治療具有重大的意義。激光共聚焦顯微鏡(CLSM)技術(shù)現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用到生物醫(yī)藥和生命科學(xué)領(lǐng)域研究中去。曼氏血吸蟲的激光共聚焦顯微鏡形態(tài)學(xué)研究已有報道,但日本血吸蟲的激光共聚焦顯微鏡形態(tài)研究至今未見文獻(xiàn)。本文我們設(shè)計單性以及雙性感染日本血吸蟲的方式感染小鼠,在雙性感染中我們分別收集感染后15天,20天,25天,30天,35天的蟲體;單性感染中我們收集感染后35天的蟲體,將這些蟲體通過固定,染色,脫色,脫水等一系列的處理后,最后于激光共聚焦顯微鏡下觀察雙性感染上述各發(fā)育階段的形態(tài)發(fā)育特點,觀察單性感染35天的形態(tài)特點。用激光共聚焦顯微鏡測量單性及雙性感染35天蟲體,包括:體長、體寬、睪丸長、睪丸寬、睪丸面積、卵巢長、卵巢寬、卵巢面積。激光共聚焦顯微鏡的觀察以及統(tǒng)計學(xué)的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙性感染中30天成蟲各器官發(fā)育成熟,雄性成蟲睪丸、抱雌溝、貯精囊、雄性生殖孔,雌性成蟲卵巢、卵黃腺、卵黃管、卵模、梅氏腺、子宮等結(jié)構(gòu)在激光共聚焦顯微鏡下結(jié)構(gòu)清晰;各發(fā)育階段蟲體形態(tài)變化最為顯著的是15-25天的蟲體。感染后15天,33%雄性蟲體已出現(xiàn)明顯抱雌溝,8%蟲體位于前端的睪丸可見含有少量排列稀疏生殖細(xì)胞,13%雌蟲出現(xiàn)早期卵巢結(jié)構(gòu),卵細(xì)胞尚未分化;感染后20天,86%雄蟲有5-7個含有較15天多的生殖細(xì)胞的睪丸,此時期生殖細(xì)胞之間界線仍不清楚。雌蟲后半部可見卵黃腺,卵黃細(xì)胞數(shù)量較少且不成熟,排列稀疏。卵巢中可見較前數(shù)量多的未成熟卵細(xì)胞,但未見細(xì)胞分化;感染后25天,所有蟲體生殖系統(tǒng)均已發(fā)育,卵黃腺中卵黃細(xì)胞明顯增多,形態(tài)不規(guī)則,排列較為緊密。卵巢內(nèi)卵細(xì)胞已出現(xiàn)細(xì)胞分化。90%以上雌蟲子宮內(nèi)可見少量蟲卵。感染30天以及以上蟲體均已發(fā)育成熟。單性感染35天蟲體與雙性相比,單性感染蟲體體積均明顯小于雙性感染蟲體,且發(fā)育均不成熟(雌蟲尤為顯著)。經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析單性感染35天蟲體體長、睪丸長、睪丸面積、卵巢長、卵巢寬、卵巢面積均與雙性感染35天蟲體有顯著性差異。 按照雙鏈RNA(dsRNA)體外合成試劑盒要求,我們從日本血吸蟲童蟲cDNA文庫中擴(kuò)增出Mago nashi基因,將其片段正、反義鏈連接上T7啟動子,然后把連接有T7啟動子的目的基因的正、反義鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA(ssRNA)并將其純化,最后把一對ssRNA混合合成dsRNA。陰性對照組我們采用試劑盒中提供的基因。在BTX電穿孔儀上,設(shè)定參數(shù)為125V電壓、20ms脈沖時值、1次脈沖次數(shù),將dsRNA電穿孔轉(zhuǎn)染入機(jī)械制備的日本血吸蟲童蟲體內(nèi),體外培養(yǎng)于電轉(zhuǎn)后第1,3,5天收集童蟲,按TRIzol方法同時提取童蟲的總RNA及總蛋白。經(jīng)實時熒光定量PCR及Western blotting分別檢測Mago nashi基因表達(dá)水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mago nashi基因的轉(zhuǎn)錄水平實驗組分別于電穿孔后第1, 3, 5天較陰性對照組下降22%,69%,80%。該基因的蛋白水平在第1, 3, 5天較陰性對照組下降12%,39%,56%。實驗結(jié)果證明dsRNA可以特異性的抑制日本血吸蟲靶基因以及蛋白的表達(dá)且效果明顯。經(jīng)dsRNA電轉(zhuǎn)的童蟲注射入小鼠體內(nèi),6周后取出蟲體通過一系列處理制成標(biāo)本,在激光共聚焦顯微鏡下觀察蟲體內(nèi)部各器官形態(tài)特征及測量蟲體體長、體寬、睪丸長、睪丸寬、睪丸面積、卵巢長、卵巢寬、卵巢面積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SjMago dsRNA組中8條中6條雄蟲睪丸內(nèi)有大量精子出現(xiàn),而雌蟲中卵巢,卵黃腺中卻沒有明顯特征變化;測得各項指標(biāo)經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析陰性對照組與SjMago dsRNA組的體寬、睪丸長、睪丸寬、睪丸面積、卵巢長、卵巢寬、卵巢面積均有顯著性差異。由此結(jié)果我們得出Mago nashi基因在日本血吸蟲中是生殖相關(guān)基因,在生殖系統(tǒng)器官的正常發(fā)育起一定作用。
[Abstract]:Schistosoma japonicum is a major infectious disease which seriously endangers people ' s health and prevents socio - economic development . Schistosoma japonicum is one of the most important strategies to control schistosomiasis .



Mago nashi gene ( Genebank accession number BM735619 ) encoded by Genebank accession number BM735619 showed at least 80 % homology in most organisms such as human , fruit fly and nematode .



Laser confocal microscopy ( CLSM ) has been widely used in the field of biomedical and life sciences . The number of egg yolk cells was less and immature , and the cells were sparse . There were more immature oocytes in the ovary , but no cell differentiation was observed .



The expression level of Mago nashi gene was detected by means of real - time fluorescence quantitative PCR and Western blotting . The results showed that the expression level of Mago nashi gene was decreased by 12 % , 39 % and 56 % after electroporation . plays a certain role in the normal development of reproductive system organs .

【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R383.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1701408