本文選題：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子　切入點(diǎn)：質(zhì)粒　出處：《中南大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 第一章重組腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子真核表達(dá)載體構(gòu)建 目的：構(gòu)建pegfpN1-BDNF真核表達(dá)載體,為體外構(gòu)建基因工程細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。 方法：RT-PCR擴(kuò)增人胚胎腦組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因片段,將基因片段與pegfpN1質(zhì)粒連接制成重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化、篩選及擴(kuò)增重組質(zhì)粒,用EcoR I和BamH I酶切分析鑒定BDNF是否插入重組質(zhì)粒。小量提取重組質(zhì)粒后進(jìn)行測序分析,將酶切檢測和測序正確的pegfpN1-BDNF重組質(zhì)粒用QIAGEN-TIP100大量提取。 結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定,成功地將BDNF與pegfpN1質(zhì)粒連接,構(gòu)建我們需要的pegfpNl-BDNF重組質(zhì)粒。 結(jié)論：成功構(gòu)建了pegfpN1-BDNF重組真核表達(dá)載體,為體外實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。 第二章腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建及誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞電生理特性的初步研究 目的：在體外構(gòu)建能過表達(dá)BDNF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),并誘導(dǎo)該基因工程細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,經(jīng)膜片鉗檢測誘導(dǎo)分化細(xì)胞的電生理特性。 方法：采用梯度密度離心法及貼壁法分離培養(yǎng)原代BMSCs,取第二-三代細(xì)胞,流式細(xì)胞儀鑒定分離培養(yǎng)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD44、CD45表達(dá)情況。將重組真核表達(dá)載體pegfpN1-BDNF及pegfpN1分別通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)染入BMSCs中,瞬轉(zhuǎn)48小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)G418篩選,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。采用全反式維甲酸誘導(dǎo)BDNF-BMSCs、BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化,細(xì)胞免疫熒光鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)以及BDNF的表達(dá)情況。采用全細(xì)胞膜片鉗記錄誘導(dǎo)后BDNF-BMSCs的生物電特性的變化,并與未分化的BMSCs對比。 結(jié)果：經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定,所分離細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45、CD44陽性表達(dá)率分別為3.19%、4.42%、96.82%,證明了分離的細(xì)胞為BMSCs。電穿孔法BMSCs的瞬轉(zhuǎn)率為10%-15%,經(jīng)G418篩選,其轉(zhuǎn)染率達(dá)到70%-80%。經(jīng)全反式維甲酸誘導(dǎo)后BDNF-BMSCs組表達(dá)NSE.GFAP分別為45.87±5.82%,21.92±2.29%,未誘導(dǎo)BDNF-BMSCs組分別為23.90±6.95%,10.23±2.08%,而誘導(dǎo)的BMSCs組為4.81±1.71%,1.93±1.34%。在檢測的15個(gè)誘導(dǎo)的BDNF-BMSCs中,膜片鉗檢測到7個(gè)細(xì)胞有似鈉離子內(nèi)向電流產(chǎn)生,與對照組比較兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：BMSCs易分離及培養(yǎng)。用電穿孔法可以建立起體外穩(wěn)定高效表達(dá)BDNF的組織工程細(xì)胞BDNF-BMSCs,經(jīng)誘導(dǎo)可以轉(zhuǎn)分化為具有一定神經(jīng)元細(xì)胞電生理特性的神經(jīng)元樣細(xì)胞。 第三章基因工程細(xì)胞經(jīng)不同途徑移植入正常聽力豚鼠耳蝸內(nèi)的比較及長期安全性的觀察 目的：比較經(jīng)鼓階與蝸軸兩種不同細(xì)胞移植途徑的特點(diǎn),同時(shí)長期觀察BMSCs在內(nèi)耳的分布及生長情況,為將來臨床細(xì)胞移植奠定基礎(chǔ)。 方法：選取40只聽力正常豚鼠,術(shù)前聽力均經(jīng)聽性腦干誘發(fā)電位(auditory brainstem response audiometry, ABR)檢測鑒定。40只豚鼠分為2組每組各20只。Ⅰ組為經(jīng)鼓階注射組,Ⅱ組為經(jīng)蝸軸注射組。將Egfp-BMSCs作為移植細(xì)胞注入,術(shù)后設(shè)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)測試術(shù)耳4KHZ、8KHZ、16KHZ的ABR閾值,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為術(shù)后7天、術(shù)后28天、術(shù)后42天。在測試ABR后,在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組處死5只豚鼠,取耳蝸?zhàn)霰鶅銮衅^察移植細(xì)胞在耳蝸內(nèi)的分布情況。其余10只豚鼠于術(shù)后6個(gè)月處死,觀察耳蝸大體標(biāo)本并做石蠟切片,觀察其形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果：Ⅰ組豚鼠術(shù)耳術(shù)后7天各個(gè)頻率ABR閾值較術(shù)前均有提高,術(shù)后28天恢復(fù)到術(shù)前水平,術(shù)后42天檢測ABR閾值無提高。Ⅱ組豚鼠術(shù)耳術(shù)后7天各個(gè)頻率ABR閾值明顯提高,術(shù)后28天檢測ABR閾值無下降,術(shù)后42天檢測ABR閾值無改變。冰凍切片顯示：鼓階注射方式,移植細(xì)胞分布于鼓階、前庭階、中階,在蝸軸未發(fā)現(xiàn)明顯移植細(xì)胞。蝸軸注射方式,移植細(xì)胞分布于蝸軸、鼓階、前庭階、中階。隨著觀察時(shí)間的延長,在耳蝸的移植細(xì)胞逐漸減少,42天后未見明顯移植細(xì)胞。細(xì)胞移植術(shù)后6個(gè)月耳蝸大體無明顯異常,未見移植細(xì)胞過度生長致腫瘤形成,石蠟HE染色切片觀察耳蝸結(jié)構(gòu)無明顯異常。 結(jié)論：鼓階注射對耳蝸創(chuàng)傷較小,是比較安全的注射方式。蝸軸注射對耳蝸創(chuàng)傷較大,但其移植細(xì)胞可在靶區(qū)定植。移植細(xì)胞在耳蝸內(nèi)能存活28-42天,BMSCs移植耳蝸內(nèi)未見致瘤性。 第四章BDNF基因修飾的BMSCs在致聾豚鼠耳蝸內(nèi)的表達(dá)與分化及對螺旋神經(jīng)元的保護(hù)作用 目的：觀察BDNF-BMSCs移植入損傷耳蝸后,移植細(xì)胞是否在體內(nèi)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞,并觀察其對SGNs的保護(hù)作用。 方法：45只氨基甙類抗生素致聾模型豚鼠分為三組。三組動(dòng)物經(jīng)鼓階途徑注入不同成分,A組為人工外淋巴液組；B組為體外誘導(dǎo)分化的BDNF-BMSCs組；C組為未誘導(dǎo)的BDNF-BMSCs組。在術(shù)后7天、28天、42天處死動(dòng)物,取耳蝸組織石蠟包埋切片。BDNF抗體免疫組化確定移植細(xì)胞分泌情況,NSE和GFAP抗體免疫組織化學(xué)檢測移植細(xì)胞發(fā)生分化情況,用平均光密度(average optical density, AOD)分析免疫化學(xué)結(jié)果及SGNs密度。 結(jié)果三組動(dòng)物均造模成功,ABR閾值大于75dB SPL。NSE和GFAP免疫組織化學(xué)可見B組、C組染色AOD值均大于A組(P0.05),B組AOD值大于C組(P0.05)。SGNs密度B組、C組高于A組,而B組、C組SGNs密度比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。隨著時(shí)間的延長其移植細(xì)胞數(shù)量減少,術(shù)后42d耳蝸內(nèi)未見明顯移植細(xì)胞。 結(jié)論BDNF-BMSCs在耳蝸內(nèi)能轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,并存活28-42d。BDNF-BMSCs對SGNs有保護(hù)作用。耳蝸內(nèi)移植在體外誘導(dǎo)分化的BDNF-BMSCs與未經(jīng)誘導(dǎo)分化的BDNF-BMSCs對損傷的SGNs都具有保護(hù)作用。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1699978