本文選題：日本血吸蟲　切入點(diǎn)：免疫診斷　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 血吸蟲病的免疫診斷主要包括抗體的檢測和循環(huán)抗原的檢測。檢測抗體特異性和敏感性均較好,但是抗體在治愈后仍在血清中存在較長的時間,難以區(qū)分現(xiàn)癥感染與既往感染,即療效考核價值不高;循環(huán)抗原的檢測可反映活動性感染,具有較好的病原檢測意義和療效考核價值,但是目前血吸蟲循環(huán)抗原的檢測特異性不高,對慢性感染者的敏感性也低。因此,建立敏感又特異的具有療效考核價值的循環(huán)抗原檢測方法是當(dāng)前血吸蟲病基礎(chǔ)研究中的一個熱點(diǎn)。 卵黃抗體(immunoglobulin Y,IgY)是特定抗原免疫母雞后產(chǎn)生的相應(yīng)抗體累積并轉(zhuǎn)移至卵黃中而形成,且是卵黃中主要的免疫球蛋白類。與哺乳動物類IgG相比,IgY具有親和力高、制備簡單經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定性好、不激活補(bǔ)體、不結(jié)合類風(fēng)濕因子,也不與哺乳動物類免疫球蛋白分子的Fc受體結(jié)合等優(yōu)點(diǎn),此外由于與哺乳動物種系發(fā)生距離遠(yuǎn),IgY不會與哺乳動物類免疫球蛋白發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng),將其用作免疫診斷試劑可以減少假陽性,提高檢測敏感性和特異性。 目的:應(yīng)用抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(soluble egg antigen,SEA)多克隆IgY和酶標(biāo)抗SEA單克隆抗體NP28-5B組合,建立一種雙抗體夾心法(sandwich ELISA,S-ELISA)檢測血吸蟲循環(huán)抗原,以探討IgY用于診斷血吸蟲病診斷的應(yīng)用價值。 方法: 1.抗日本血吸蟲SEA雞卵黃抗體的制備與鑒定:用日本血吸蟲SEA經(jīng)翅膀下靜脈和皮下免疫25周齡海蘭母雞4次(首次劑量為60μg/只,加強(qiáng)劑量為30μg/只),每次間隔10d。取免疫前和首次免疫后35d的雞蛋卵黃,分別用水稀釋法提取純化IgY。BCA法(2.2′-Bicinohoninic acid.BCA)測定純化后IgY的濃度,并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)分析其相對分子量和純度,間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(indirect-ELIsA)檢測IgY的活性與特異性。 2.抗SEA單克隆抗體NP28-5B的制備及酶標(biāo)記:取感染日本血吸蟲尾蚴的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與同系小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。采用間接ELISA法篩選陽性克隆,陽性孔細(xì)胞經(jīng)反復(fù)亞克隆,至所有雜交瘤細(xì)胞生長孔的培養(yǎng)上清均能與SEA產(chǎn)生陽性反應(yīng)為止,此時確認(rèn)抗SEA單克隆抗體NP28-5B細(xì)胞系建立。經(jīng)傳代培養(yǎng)后,收集雜交瘤細(xì)胞上清,用50%硫酸銨沉淀后,溶解于10 mM PBS(PH7.4),充分透析后,凍存于-70℃?zhèn)溆�。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記NP28-5B(簡易過碘酸鈉法)。 3.IgY檢測日本血吸蟲循環(huán)抗原雙抗體夾心法的建立:以純化的雞IgY作為捕獲抗體,以HRP標(biāo)記的NP28-5B為檢測抗體建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(S-ELISA)。運(yùn)用正交試驗(yàn)對所建立的方法從包被抗體濃度、血清孵育時間、酶標(biāo)抗體濃度和酶標(biāo)抗體孵育時間四個方面進(jìn)行優(yōu)化。并和常規(guī)檢測抗體的SEA-ELISA同時檢測若干份急、慢性血吸蟲病人和健康人血清。 4.感染血清來源:9份急性血吸蟲病人血清和45份慢性血吸蟲病人血清分別采自江西九江都昌縣血防所和云南省大理白族自治州巍山縣鼠街鄉(xiāng)鼠街村。健康者血清50份取自非血吸蟲病流行區(qū)的山東省濱州市。 結(jié)果: 1.海蘭母雞經(jīng)SEA首次免疫后10d即有特異性IgY產(chǎn)生,加強(qiáng)免疫后效價逐步上升,至35d,每枚蛋經(jīng)提純后可得到約61mg抗體,經(jīng)非還原型SDS-PAGE分析,純化的IgY有1條主要蛋白帶,相對分子量為130000。還原型SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,裂解后的IgY共7條帶,其中含有Mr為66000和35000的2條主帶。 2.NP28-5B雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)50%硫酸銨溶液沉淀、充分透析后所得抗體濃度為61.75mg/ml,間接ELISA法測得抗體有活性;簡易過碘酸鈉法標(biāo)記酶后的工作濃度為1:600～1:1000。 3.S-ELISA法測得SEA濃度(y)與吸光度(A450)值(x)在2.25ng/mL～900 ng/mL之間內(nèi)呈線性關(guān)系(r=0.948,1,y=459.22x-108.14),最低的檢出限為2.2 5ng。檢測急性血吸蟲病人循環(huán)抗原的陽性率為100.00%(9/9),慢性血吸蟲病人循環(huán)抗原的陽性率為84.40%(38/45),健康人的特異性為96.00%(48/50)。與SEA-ELISA法對血吸蟲病的檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論: 1.SEA免疫母雞后可產(chǎn)生抗SEA的IgY。 2.所建立的S-ELISA法檢測日本血吸蟲循環(huán)抗原有較好的敏感性與特異性,可用于血吸蟲病的免疫診斷。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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1 肖飛;抗犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病二聯(lián)卵黃抗體的制備及其臨床治療效果觀察[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

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本文編號：1698072