本文選題：肺炎克雷伯菌　切入點(diǎn)：MrkD　出處：《吉林大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.pn)是革蘭氏陰性菌,屬于腸桿菌科克雷伯菌屬,可在全身許多器官引發(fā)感染,但最高的發(fā)病機(jī)率在泌尿生殖道和肺部。當(dāng)機(jī)體免疫力下降或者大量長(zhǎng)期濫用抗生素引發(fā)菌群失調(diào)時(shí)導(dǎo)致感染,可引起腦膜炎、肺炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎、傷口感染甚至敗血癥等,給臨床治療帶來了許多麻煩,治療不好則發(fā)病死亡率極高。雖然抗生素的使用,在目前可以有效治療感染性疾病,可是當(dāng)感染范圍比較大,藥物產(chǎn)生不良反應(yīng)、多重耐藥菌株逐年增加,而且停止使用后發(fā)生再次感染等因素,使抗生素治療的臨床使用遇到難題。由于人們對(duì)K.pn結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)的加深,通過疫苗預(yù)防來防治K.pn侵襲增加了可行性,對(duì)于其疫苗的研究也逐漸升溫,有重要的意義。 本研究首先對(duì)肺炎克雷伯菌的粘附素MrkD蛋白是否為主要保護(hù)性抗原進(jìn)行了鑒定。采用原核表達(dá)得到純化的粘附素MrkD蛋白,通過激光共聚焦顯微鏡觀察粘附定位,進(jìn)而通過粘附抑制與粘附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)證明粘附素MrkD蛋白的粘附阻斷作用,最后通過免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn),最終證實(shí)了菌毛粘附素MrkD蛋白可以作為肺炎克雷伯菌的主要保護(hù)性抗原,可用作進(jìn)一步的表位疫苗研究。 為獲取用于篩選粘附素MrkD蛋白B細(xì)胞表位的單克隆抗體,利用融合蛋白rMrkD作為免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),采用間接ELISA篩選穩(wěn)定分泌針對(duì)MrkD蛋白的單克隆抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后,制備單抗腹水,對(duì)所得單克隆抗體的效價(jià)、親和力、特異性等進(jìn)行鑒定。制備出了1株能穩(wěn)定分泌抗MrkD蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株E01,其中抗體亞類為IgG1,腹水效價(jià)為1:256,000,相對(duì)親和力為0.3μg/mL,特異性反應(yīng)顯示,與大腸埃希菌,副傷寒沙門菌,銅綠假單胞菌,產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特桿菌均無交叉反應(yīng)性。為下一步篩選鑒定MrkD蛋白的B細(xì)胞表位提供基礎(chǔ)。 為篩選鑒定MrkD蛋白的B細(xì)胞表位,用純化的抗MrkD蛋白的單克隆抗體作為篩選配基,對(duì)噬菌體展示隨機(jī)12肽文庫進(jìn)行三輪生物親和淘選,高親和力噬菌體得以富集;通過夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定出了33個(gè)陽性噬菌體克隆,為了找到核心序列,從中挑選16個(gè)陽性克隆進(jìn)行序列測(cè)定和分析。發(fā)現(xiàn)陽性克隆大多呈遞QKTLAKSTYMSA序列,其第3、4、5、9和11位置上的T、L、A、Y、S氨基酸與MrkD氨基酸殘基(148-159位)有較高同源。說明T、L、A、Y、S可能決定了此B細(xì)胞表位的抗原性質(zhì),是該B細(xì)胞表位構(gòu)成的關(guān)鍵氨基酸。使用帶有QKTLAKSTYMSA序列的C1噬菌體克隆免疫BALB/c小鼠,通過ELISA和Western-blotting分析結(jié)果證實(shí)具有刺激小鼠產(chǎn)生抗體的能力,從而證明了M148-159是MrkD蛋白的B細(xì)胞表位。 對(duì)MrkD蛋白的Th細(xì)胞表位的篩選鑒定,Th細(xì)胞表位體外實(shí)驗(yàn)鑒定首先采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)MrkD蛋白可能的H-2d限制性Th表位,并合成表位肽,采用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、流式細(xì)胞分析等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了篩選和鑒定,獲得BALB/c小鼠H-2d限制性Th細(xì)胞表位三條(M221-235,M175-189和M264-278),通過進(jìn)行表位肽協(xié)同刺激試驗(yàn),ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)三個(gè)表位之間具有協(xié)同刺激效應(yīng),發(fā)現(xiàn)M221-235和M175-189為Th2細(xì)胞表位,M264-278為Th1細(xì)胞表位。Th細(xì)胞表位體內(nèi)鑒定試驗(yàn)首先用已初步鑒定的表位多肽(M221-235,M175-189和M264-278)免疫BALB/c小鼠,進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)來檢測(cè)多肽免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答,通過半定量RT-PCR檢測(cè)多肽免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá),發(fā)現(xiàn)三個(gè)表位肽能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的CD+4 T淋巴細(xì)胞應(yīng)答,表位肽致敏的淋巴細(xì)胞能識(shí)別相應(yīng)多肽及rMrkD。 在篩選鑒定得到了1個(gè)B細(xì)胞表位和3個(gè)Th細(xì)胞表位的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了肺炎克雷伯菌表位疫苗的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及免疫原性研究,通過三組柔性氨基酸將此四個(gè)表位依次串聯(lián)并進(jìn)行人工合成,構(gòu)建重組質(zhì)粒KMepi的。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,挑取單菌落以IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳觀察蛋白表達(dá)情況,與對(duì)照組相比在31kD與45kD之間有目的蛋白的表達(dá)。純化的EPI蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,表位疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體。 總之,本課題證實(shí)了MrkD蛋白作為主要保護(hù)性抗原,并篩選鑒定了MrkD的1個(gè)B細(xì)胞表位和3個(gè)Th表位,并對(duì)表位的免疫學(xué)特性進(jìn)行了研究,在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)、構(gòu)建了K.pn表位疫苗。構(gòu)建的K.pn表位疫苗使包含的Th表位及B細(xì)胞表位各自發(fā)揮功能,為K.pn表位疫苗研究奠定了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 石統(tǒng)東,吳玉章,周偉,賈正才,鄒麗云;多表位組合肽誘導(dǎo)HLA-A2~+人PBMC產(chǎn)生抗原特異性CD8~+T細(xì)胞應(yīng)答的研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年12期

2 陶錦華,李康然,韋平;石龜肺炎克雷伯氏菌感染的診斷與防治[J];廣西畜牧獸醫(yī);2002年06期

3 張海艇;小鼠由肺炎克雷伯氏菌引發(fā)疫病的報(bào)告[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);1998年06期

4 徐海圣,舒妙安;中華鱉肺炎克雷伯氏菌病的病原研究[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版);2002年06期

5 郭定宗,胡薛英,周詩其,李家奎,汪民權(quán),杜有順,余漢成;金絲猴肺炎克雷伯氏菌及埃希氏大腸桿菌敗血癥的病理學(xué)觀察[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2001年01期

6 賈艷;雷連成;何禮洋;楊洋;韓俊友;韓文瑜;;豬源肺炎克雷伯菌的分離與鑒定[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年02期

7 路菊;孫瑋;陳德英;;免疫熒光雙重染色的激光共聚焦顯微鏡樣品制備及觀察[J];免疫學(xué)雜志;2007年03期

8 羅萍,毛旭虎,趙莉莉;KDEL修飾的HSV-2CD8~+T細(xì)胞表位促進(jìn)CTL效應(yīng)的研究[J];中華男科學(xué)雜志;2005年04期

9 彭廣能,熊焰;大熊貓肺炎克雷伯氏菌的研究現(xiàn)狀[J];四川畜牧獸醫(yī);2000年S1期

10 郭強(qiáng)忠;何林;唐曙明;龔文勝;;117株肺炎克雷伯菌的耐藥性分析[J];檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2006年04期

，

本文編號(hào)：1695710