本文選題：超廣譜β內(nèi)酰胺酶　切入點(diǎn)：表型確證試驗(yàn)　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年碩士論文

【摘要】： 背景和目的 β內(nèi)酰胺類抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用為人類抵御細(xì)菌感染做出了巨大貢獻(xiàn),但隨著抗生素的廣泛、大量使用,細(xì)菌耐藥性問題,尤其是由超廣譜β內(nèi)酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)介導(dǎo)的β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性,導(dǎo)致細(xì)菌對臨床常用抗生素耐藥。不適當(dāng)?shù)某跏伎股刂委?可引起病人住院時間延長、費(fèi)用增加,并可能導(dǎo)致死亡率上升。因此快速準(zhǔn)確檢測超廣譜β內(nèi)酰胺酶,將有助于相應(yīng)感染性疾病的治療和預(yù)防。 檢測超廣譜β內(nèi)酰胺酶的方法可分為表型鑒定法和分子生物學(xué)方法。表型鑒定法包括CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)推薦的ESBLs檢測法(包括篩選試驗(yàn)和表型確證試驗(yàn)),三維試驗(yàn),Etest ESBLs條,Vitek ESBLs檢測卡,Microscan ESBLs檢測板和BD Phoenix自動化微生物系統(tǒng)等。分子生物學(xué)方法包括DNA探針法,寡核苷酸分型,PCR-RFLP,PCR-SSCP,連接酶反應(yīng),Real-time PCR和核酸測序法等。 Vitek-2高級專家系統(tǒng)通過對多種抗生素最小抑菌濃度的分析來推測ESBLs表型,通常對細(xì)菌藥敏結(jié)果給出多種參考結(jié)果,這要求檢測者具有豐富的經(jīng)驗(yàn)。檢測者一旦將菌株確認(rèn)為產(chǎn)ESBLs,儀器會自動將體外測試敏感的藥物修改為耐藥表型,極大地限制了臨床應(yīng)用藥物的種類。為確證Vitek-2儀器配套藥敏卡AST-GN10(ref 22009)和AST-N021(ref 22030)推測產(chǎn)ESBLs結(jié)果的可靠性和找到一種簡便實(shí)用的鑒定ESBLs的方法,我們收集高級專家系統(tǒng)提示產(chǎn)ESBLs的G~-菌(主要為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌),用CLSI(Clinical and LaboratoryStandards Institute)推薦的藥敏紙片表型確證方法和PCR基因分型法進(jìn)行研究。 方法 實(shí)驗(yàn)分三個部分。首先收集Vitek-2提示ESBLs陽性菌株采用國產(chǎn)藥敏紙片進(jìn)行表型確證試驗(yàn),然后對所有確證試驗(yàn)陽性菌株和部分陰性菌株進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增、測序、與已知基因序列比對,最后將設(shè)計(jì)引物應(yīng)用到熒光染料法實(shí)時PCR擴(kuò)增,建立了TEM、SHV和CTX-M型ESBLs熒光染料法實(shí)時PCR檢測的方法。 結(jié)果及討論 1表型確證試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Vitek-2高級專家系統(tǒng)和藥敏紙片確證試驗(yàn)兩種方法一致性達(dá)到89.7%(78/87,僅計(jì)算CLSI紙片確證法推薦應(yīng)用菌株)。對于那些受經(jīng)濟(jì)條件限制,無法得到Vitek-2儀器的醫(yī)院,可以應(yīng)用國產(chǎn)藥敏紙片進(jìn)行ESBLs檢測。10株Vitek-2提示產(chǎn)ESBLs菌株,應(yīng)用紙片法確證試驗(yàn)未達(dá)ESBLs陽性標(biāo)準(zhǔn)。這些差異需要分子生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)5株陰溝腸桿菌、1株弗勞地枸櫞酸桿菌儀器提示產(chǎn)ESBLs,紙片確證試驗(yàn)也陽性,但CLSI尚未把這些細(xì)菌列入產(chǎn)ESBLs確證試驗(yàn)范圍,有望用分子生物學(xué)方法解決這一問題。我們同時對紙片測試提示頭孢西丁耐藥的菌株(Vitek提示通透性改變)用酶粗提物三維試驗(yàn)和藥敏紙片細(xì)菌直接測試法進(jìn)行質(zhì)粒頭孢菌素酶檢測,僅一株細(xì)菌表型檢測陽性,推測本院產(chǎn)ESBLs菌頭孢西丁抗性可能主要由于細(xì)菌膜通透性改變引起。 2常規(guī)PCR反應(yīng)及測序結(jié)果 根據(jù)文獻(xiàn)發(fā)表的基因序列,應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件,在TEM、SHV和CTX-M型耐藥基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,對已知基因型菌株(TEM和SHV)及表型方法確證為產(chǎn)ESBLs的G~-菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物TEM、SHV、CTX-M-3、CTX-M-19均得到擴(kuò)增產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)多數(shù)細(xì)菌攜帶TEM和CTX-M-1群耐藥基因,部分細(xì)菌攜帶SHV和CTX-M-9群耐藥基因。擴(kuò)增結(jié)果同時提示在院內(nèi)還未出現(xiàn)攜帶CTX-M-8、2、25群基因的細(xì)菌。本文設(shè)計(jì)的引物對不攜帶耐藥基因的標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增結(jié)果為陰性。通過對肺炎克雷伯菌(標(biāo)本號為071703的)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測序并將測序結(jié)果與Pubmed公布基因比對,同源性均在98%以上。證明此四對引物可特異擴(kuò)增相應(yīng)基因,適合今后開展臨床基因擴(kuò)增研究。 應(yīng)用設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增,大腸埃希菌中TEM型、CTX-M-1群、CTX-M-9群基因產(chǎn)物陽性率分別為85.2%,63.0%,48.1%。肺炎克雷伯菌中TEM型、SHV型、CTX-M-1群、CTX-M-9群基因產(chǎn)物陽性率分別為64.0%,68.0%,56.0%,28.0%。TEM、SHV型ESBLs基因的鑒別主要依賴全基因測序,因此攜帶這些基因的細(xì)菌可能僅代表具有廣譜耐藥性,是否為產(chǎn)ESBLs菌需進(jìn)一步驗(yàn)證。CTX-M-1群、CTX-M-9群基因在大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌均有擴(kuò)增,提示CTX-M型酶為院內(nèi)優(yōu)勢ESBLs。部分菌株同時攜帶CTX-M-1,CTX-M-9這兩種同一基因型不同亞群耐藥基因,此兩種基因是否存在于同一質(zhì)�；蛘献由霞皟煞N基因表達(dá)的調(diào)控及相互關(guān)系值得進(jìn)一步研究。 應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物可同時擴(kuò)增TEM/SHV耐藥基因,但只在部分細(xì)菌中得到兩種不同基因產(chǎn)物,而多數(shù)菌只得到一種擴(kuò)增產(chǎn)物。同時應(yīng)用兩種CTX-M型引物擴(kuò)增,只得到一種產(chǎn)物,不能同時得到兩種不同基因產(chǎn)物。此種差異可能與引物設(shè)計(jì)有關(guān)(不同引物引發(fā)效率不同),也可能菌體內(nèi)兩種基因含量處于不同的比例,只在合適的比例時才能同時擴(kuò)增。 實(shí)驗(yàn)過程中探索多種用于PCR擴(kuò)增的質(zhì)粒提取方法。采用質(zhì)粒提取試劑盒法、多個克隆煮沸離心法、液體增菌煮沸離心法提取的質(zhì)粒作為模板,均能得到理想擴(kuò)增,而多個克隆煮沸離心法最簡便易行,如果和紙片法常規(guī)藥敏試驗(yàn)使用相同的克隆制備菌液,可以節(jié)省反應(yīng)時間,快速檢測出產(chǎn)ESBLs菌。 3 SYBR法實(shí)時PCR檢測 應(yīng)用SYBR法可實(shí)時檢測基因表達(dá)情況,應(yīng)用熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物而不是凝膠電泳觀察,降低了產(chǎn)物擴(kuò)散污染的幾率,而且擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線分析保證了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,因此在科研工作中得到廣泛應(yīng)用。 應(yīng)用設(shè)計(jì)的TEM、SHV、CTX-M-3引物擴(kuò)增產(chǎn)ESBLs菌,反應(yīng)參數(shù)由普通PCR做適當(dāng)修改即可在Roche Lightcycler儀器上應(yīng)用,且熔解曲線分析為單個特異峰。CTX-M-19上下游引物配對擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線分析出現(xiàn)兩個波峰;而用簡并引物CTX-M-26上游引物和CTX-M-19下游引物配合可擴(kuò)增出CTX-M-9群基因產(chǎn)物,熔解曲線分析為單個特異峰,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳觀察與預(yù)期片段大小一致。 應(yīng)用定量細(xì)菌直接煮沸法提取質(zhì)粒模板的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)菌數(shù)量在10~2/μl以上時,可以順利進(jìn)行實(shí)時熒光擴(kuò)增,而達(dá)到此等數(shù)量的細(xì)菌,僅需數(shù)個細(xì)菌克隆。直接挑取細(xì)菌克隆煮沸法制備質(zhì)粒模板可節(jié)省時間和費(fèi)用,可以在細(xì)菌質(zhì)粒耐藥研究中需要少量模板時使用。應(yīng)用SHV、CTX-M-3引物擴(kuò)增定量細(xì)菌模板,用擬合點(diǎn)法可得到一條較好的擴(kuò)增曲線,能對不同菌株耐藥基因含量進(jìn)行相對定量。但耐藥基因相對定量結(jié)果對臨床用藥是否有指導(dǎo)意義,仍須進(jìn)一步研究。我們應(yīng)用Roche lightcycler PCR擴(kuò)增儀對表型確證試驗(yàn)及普通PCR擴(kuò)增陽性的部分菌株進(jìn)行了實(shí)時PCR檢測和熔解曲線分析,確定了最佳反應(yīng)條件及在此試驗(yàn)條件下的各反應(yīng)產(chǎn)物的熔解溫度。為今后進(jìn)一步設(shè)計(jì)探針法實(shí)時定量檢測攜帶ESBLs基因菌株打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:Background and Purpose


The discovery and use of beta - lactam antibiotics has contributed significantly to human defense against bacterial infections , but with the widespread use of antibiotics , the problem of bacterial resistance , especially the resistance of beta - lactam antibiotics mediated by extended - spectrum beta - lactamase , which leads to prolonged hospitalization , increased costs , and may lead to an increase in mortality .


Molecular biological methods include DNA probe , oligonucleotide typing , PCR - RFLP , PCR - SSCP , ligase reaction , Real - time PCR and nucleic acid sequencing .


By analyzing the minimum inhibitory concentration of various antibiotics , the high - level expert system of VMC - 2 has been used to predict the phenotype of the spectrum , which usually gives many reference results to the results of the drug susceptibility test . In order to confirm the reliability of the results and find a simple and practical method for the identification of the products , we collect the drug sensitive cards AST - GN10 ( ref 22009 ) and AST - N021 ( ref 22030 ) , which are used to confirm the clinical application drugs . To confirm the VMC - 2 instrument kit , AST - GN10 ( ref 22009 ) and AST - N021 ( ref 22030 ) , we collect the G ~ - bacteria ( mainly E . coli and Klebsiella pneumoniae ) producing the products , and we study the phenotype confirmation method of the drug - sensitive paper sheet recommended by the Clinical and Laboratory Standards Institute and the PCR genotyping method .


method


In this paper , three parts were divided into three parts . First , the positive strains were collected by using domestic drug - sensitive paper . The positive strains and some negative strains were amplified by routine PCR , sequenced and compared with the known gene sequences . Finally , the primers were applied to real - time PCR amplification of fluorescent dye method , and the real - time PCR detection method of TEM , SHV and CTX - M - type extended - PCR was established .


Results and Discussion


1 phenotype confirmation test


The experimental results show that the consistency of the two methods is 89.7 % ( 78 / 87 , only the application strain is recommended for the validation method of the sheet validation method ) . For those with limited economic conditions , we can ' t get the hospital of VMC - 2 instrument . It is possible to use domestic drug - sensitive paper to test . Ten strains of VMC - 2 have been used to test the producing strains . The results show that 5 strains of enterobacter clostrium and 1 strain of Floridi citrate are positive for the test . However , we have not listed these bacteria in the scope of producing extended - producing strains , and it is expected to use molecular biology method to test the problem .


2 Routine PCR reactions and sequencing results


The primers were designed according to the gene sequence published in the literature , and the primers were designed in the conserved regions of TEM , SHV and CTX - M resistant genes .


The positive rates of TEM , SHV , CTX - M - 1 and CTX - M - 9 in Escherichia coli were 85.2 % , 63.0 % and 48.1 % , respectively . The positive rates of TEM , SHV , CTX - M - 1 and CTX - M - 9 were 64 . 0 % , 68 . 0 % , 56 . 0 % and 28 . 0 % respectively .


Two kinds of CTX - M primers were used to amplify only one product and two different gene products could not be obtained at the same time .


A plurality of plasmid extraction methods for PCR amplification are explored in the experiment process . The plasmid extraction kit method , a plurality of cloning boiling centrifugation methods , and a liquid enrichment boiling centrifugal method are used as a template to obtain ideal amplification , and a plurality of clone boiling centrifugation methods are most simple and feasible .


3 SYBR Method Real - time PCR Detection


SYBR method can be used to detect gene expression in real time , and melting curve is used to analyze the amplification product instead of gel electrophoresis . The probability of product diffusion pollution is reduced , and the melting curve analysis of amplification product guarantees the specificity of amplification product , so it is widely used in scientific research .


CTX - M - 19 upstream primer and CTX - M - 19 upstream primer and CTX - M - 19 downstream primer were used to amplify the CTX - M - 9 gene product .


It was found that when the number of bacteria was above 10 ~ 2 / 渭l , real - time fluorescence amplification could be carried out smoothly , and only a few bacterial clones were needed .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R378;R516

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)會議論文 前6條

1 裴鳳艷;;276株大腸埃希菌的耐藥性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議資料匯編[C];2008年

2 李智山;趙建忠;周樂翔;楊燕;鄧三季;鄒玖明;;國內(nèi)首次從大腸埃希菌發(fā)現(xiàn)blaCTX-M-55型超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因[A];湖北省暨武漢市微生物學(xué)會分析微生物專業(yè)委員會第十屆第五次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

3 向成玉;林燕英;林燕;;下呼吸道感染細(xì)菌產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的檢測[A];第五次全國中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

4 于本章;王際亮;王秀麗;張炎芳;楊紅起;;我院2007年大腸埃希菌和克雷伯菌屬ESBLs檢測及耐藥性分析[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議資料匯編[C];2008年

5 錢英;裘云慶;俞云松;陳亞崗;李蘭娟;;產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的qnrA基因檢測[A];第九次浙江省中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

6 曾賢銘;孫長貴;楊燕;;腸桿菌科常見細(xì)菌產(chǎn)ESBLs與AmpC酶分析[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議資料匯編[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前3條

1 仇逸 葉國標(biāo);醫(yī)院內(nèi)使用抗生素存在三重誤區(qū)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2004年

2 ;根據(jù)β內(nèi)酰胺酶選擇有效抗生素[N];中國醫(yī)藥報;2003年

3 ;正確評價和合理使用抗生素[N];中國醫(yī)藥報;2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 田素飛;社區(qū)兩種耐藥菌的耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

2 蔣琰;腸桿菌科細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 陳天寶;產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細(xì)菌的表型及分子生物學(xué)研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2009年

2 賀靖冬;腸桿菌科細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2006年

3 徐令清;質(zhì)粒介導(dǎo)頭孢菌素酶的分子生物學(xué)研究[D];中南大學(xué);2007年

4 王苒;頭孢他啶對產(chǎn)CTX-M-14型超廣譜β內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌大鼠肺炎的治療研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2007年

，

本文編號：1694197