本文選題：乙型肝炎病毒　切入點(diǎn)：表面抗原　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 目的觀察乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)大蛋白(LHBs),中蛋白(MHBs)和小蛋白(SHBs)DNA疫苗的免疫原性,分析其免疫應(yīng)答模式及機(jī)制,為研究開發(fā)免疫原性更優(yōu)的乙型肝炎病毒(HBV)預(yù)防或治療性疫苗提供理論依據(jù)。 方法我們?cè)O(shè)計(jì)了HBV adr亞型HBsAg共識(shí)基因(consensus S gene for HBV adr subtype,adr-S-Cons),并據(jù)此構(gòu)建了乙肝病毒LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗,經(jīng)酶切和基因測(cè)序鑒定其構(gòu)建正確;肌肉注射、活體基因?qū)敕绞椒謩e對(duì)Balb/c小鼠分別進(jìn)行LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗免疫,第0、2和4周共免疫3次,于每次免疫前和末次免疫后每?jī)芍苁占?ELISA和Western blot法檢測(cè)LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗表達(dá)產(chǎn)物與三種DNA疫苗免疫血清之間的相互識(shí)別;酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)法檢測(cè)LHBs,MHBs和SHBs免疫小鼠的抗原特異性抗體分泌細(xì)胞(ASCs)檢測(cè);同法檢測(cè)LHBs,MHBs和SHBs免疫小鼠的抗原特異性細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2)分泌細(xì)胞。 結(jié)果1. DNA質(zhì)粒經(jīng)雙酶切,可見分子量約1200bp、850bp及700bp的插入基因片段,與LHBs、MHBs、SHBs預(yù)期大小相符,測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列進(jìn)行比對(duì),兩者吻合率為100%。 2. Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明,三種DNA疫苗的小鼠免疫血清對(duì)LHBs、MHBs和SHBs抗原成分均有一定程度的識(shí)別。 3.第一次免疫后兩周3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(LHBs、MHBs和SHBs免疫組)小鼠血清以ELISA法均能分別檢測(cè)到抗商品化HBsAg、LHBs、MHBs和SHBs的特異性抗體。在第三次免疫后兩周,3個(gè)實(shí)驗(yàn)組抗商品化HBsAg、LHBs、MHBs和SHBs的抗體滴度達(dá)峰值。LHBs、MHBs和SHBs DNA疫苗免疫后小鼠抗血清與商品化HBsAg抗原的結(jié)合能力,以SHBs抗血清最強(qiáng),MHBs次之,LHBs再次之;與LHBs抗原的結(jié)合能力,以MHBs免疫后血清最強(qiáng);與MHBs抗原的結(jié)合能力,以MHBs抗血清最強(qiáng),SHBs次之,LHBs再次之;與SHBs抗原的結(jié)合能力,以MHBs和SHBs免疫后血清為高。 4.抗原特異性ASCs檢測(cè)結(jié)果顯示,商品化HBsAg抗原特異性ASCs數(shù)量在LHBs、MHBs和SHBs免疫組三組間兩兩比較均有顯著性差異,P0.05,以SHBs組每107細(xì)胞中ASC數(shù)量最多,MHBs次之;LHBs抗原特異性ASC檢測(cè),LHBs、MHBs和SHBs三組間兩兩比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05;MHBs抗原特異性ASCs檢測(cè),LHBs、MHBs和SHBs三組間比較,LHBs與其他兩組比較均有顯著性差異,P0.01,MHBs組抗原特異性ASCs數(shù)量最多,MHBs和SHBs組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05;SHBs抗原特異性ASCs檢測(cè),LHBs、MHBs和SHBs三組間兩兩比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05,但以MHBs組抗原特異性ASCs數(shù)量為多。 5. LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗免疫小鼠的抗原特異性IFN-γ、IL-2分泌細(xì)胞檢測(cè)表明,這兩種細(xì)胞因子的分泌細(xì)胞數(shù)量在LHBs、MHBs和SHBs三組中比較,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05。 結(jié)論1、本研究構(gòu)建的乙肝病毒LHBs、MHBs和SHBs三種DNA疫苗均能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。 2、LHBs、MHBs和SHBs DNA疫苗對(duì)Balb/c小鼠的免疫原性有所不同,差別主要在體液免疫方面,而T細(xì)胞免疫方面未見明顯差異。 3、比較LHBs、MHBs或SHBs三種DNA疫苗的免疫原性,在本實(shí)驗(yàn)體系中,以含preS2區(qū)的MHBs DNA疫苗為最強(qiáng),SHBs次之,LHBs最弱。 4、鑒于MHBs DNA疫苗的良好免疫原性和HBV pre-S區(qū)免疫應(yīng)答對(duì)HBV感染防治的重要意義,應(yīng)將MHBs抗原列為重要的乙肝疫苗候選抗原。
[Abstract]:Objective to investigate the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) protein (LHBs), protein (MHBs) and protein (SHBs) DNA vaccine and analysis of its immune response pattern and mechanism for the development of hepatitis B virus on immunogenicity better (HBV) provides a theoretical basis for the prevention or treatment of the vaccine.
Methods we designed the HBV subtype ADR HBsAg gene (consensus S gene for on HBV adr subtype, adr-S-Cons), and constructs the hepatitis B virus LHBs, MHBs and SHBs DNA vaccine by enzyme digestion and gene sequencing to identify the correct construction; intramuscular injection of in vivo gene type of Balb/c mice were respectively LHBs. MHBs and SHBs DNA vaccine, 0,2 and 4 weeks were immunized 3 times, each time before immunization and every two weeks after the last immunization, serum was collected for detection of LHBs and Western; ELISA blot, MHBs and SHBs DNA vaccine expressing the mutual recognition between products and three kinds of DNA vaccine immune serum enzyme linkedimmunospot (; ELISPOT) assay to detect LHBs antigen specific antibody in mice immunized with SHBs and MHBs secreting cells (ASCs) detection; the same method for the detection of LHBs antigen specific cytokine MHBs and SHBs mice (IFN-, IL-2) of secretory cells.
Results 1. DNA plasmid was digested by double enzymes. The inserted gene fragment with molecular weight of 1200bp, 850bp and 700bp was consistent with the expected size of LHBs, MHBs and SHBs. The sequencing results were compared with design sequences, and the coincidence rate between them was 100%..
The results of 2. Western blot assay showed that the immune sera of the three DNA vaccines were identified to a certain extent for the LHBs, MHBs and SHBs antigen components.
Two weeks after the first immunization 3. 3 experimental groups (LHBs, MHBs and SHBs immune group) in serum of mice were detected by ELISA method against commercial HBsAg, respectively LHBs, MHBs and SHBs specific antibody. In two weeks after the third immunization, 3 experimental groups of anti commercial HBsAg, LHBs. Antibody titer of MHBs and SHBs reached the peak at.LHBs, MHBs and SHBs DNA vaccine immunized mice antiserum with commercial HBsAg antigen binding ability with SHBs antiserum, the strongest, followed by MHBs, LHBs again; and binding ability of LHBs antigen, MHBs in serum after immunization with the strongest; MHBs antigen binding ability to MHBs was strongest, followed by SHBs, LHBs again; and binding ability of SHBs antigen, MHBs and SHBs in serum after immunization is high.
4. antigen specific ASCs detection results showed that the commercial HBsAg antigen specific ASCs in the number of LHBs, MHBs and SHBs groups were significantly difference of 22 P0.05 between the three groups, with group SHBs per 107 cells ASC up, MHBs times; LHBs antigen specific ASC detection, LHBs, MHBs and SHBs three comparison between the 22 groups were not statistically significant, P0.05; MHBs antigen specific ASCs detection, LHBs, MHBs and SHBs of the three groups, LHBs compared with the other two groups have significant difference, P0.01, MHBs group the number of antigen specific ASCs, MHBs and SHBs group showed no significant difference between the ratio, P0.05; SHBs antigen specific ASCs detection, LHBs, MHBs and SHBs three between the 22 groups were no statistically significant difference, P0.05, but the number of MHBs antigen specific ASCs.
5. LHBs, MHBs and SHBs DNA vaccine immunized mice antigen specific IFN- gamma, IL-2 secretory cells showed that the number of these two cytokines secretion cells in LHBs, MHBs and SHBs three groups were not statistically different, P0.05..
Conclusion 1, the three DNA vaccines of hepatitis B virus LHBs, MHBs and SHBs constructed in this study can induce corresponding immune responses in mice.
2, the immunogenicity of LHBs, MHBs and SHBs DNA vaccines to Balb/c mice was different, and the difference was mainly in humoral immunity, but there was no significant difference in T cell immunity.
3, compare the immunogenicity of three DNA vaccines of LHBs, MHBs or SHBs. In this experimental system, the MHBs DNA vaccine containing preS2 region is the strongest, SHBs times and LHBs is the weakest.
4, in view of the good immunogenicity of MHBs DNA vaccine and the importance of HBV pre-S area immune response to the prevention and control of HBV infection, MHBs antigen should be listed as an important hepatitis B vaccine candidate antigen.

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1692074