本文選題：肺炎鏈球菌　切入點(diǎn)：假想蛋白　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 背景由于肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)抗生素耐藥率的增加和目前疫苗本身的缺陷,使得其防治成為了一個(gè)很棘手的問(wèn)題。要想徹底解決這個(gè)問(wèn)題,就要深入其致病機(jī)制,為新藥物和疫苗的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。 在前期研究中,我們通過(guò)體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(IVET),篩選出了與肺炎鏈球菌毒力相關(guān)的體內(nèi)誘導(dǎo)基因(in vivo-induced gene, ivi gene)。經(jīng)過(guò)對(duì)這些基因的生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)spd-0873基因所編碼的產(chǎn)物,假想蛋白SPD-0873與肺炎鏈球菌中的LytC有相似的功能結(jié)構(gòu)域,LytC的陰性突變菌株生物被膜形成能力下降。所以我們推測(cè)它是一個(gè)功能類似于LytC的新的毒力因子。 目的本研究將對(duì)假想蛋白SPD-0873的生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定,并探索spd-0873基因影響細(xì)菌毒力的機(jī)制。 方法通過(guò)水解底物PNP-(GlcNAc)5實(shí)驗(yàn)來(lái)確定蛋白SPD-0873是否具有溶菌酶的功能;采用長(zhǎng)臂同源多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Long flanking homology polymerase chain reaction,LFH-PCR)方法制備spd-0873缺陷菌,利用小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)比較缺陷菌和野生菌的毒力是否存在差異;通過(guò)描繪細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、透射電鏡、莢膜染色來(lái)觀察體內(nèi)、外莢膜合成能力、體外粘附宿主細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等方法,進(jìn)一步了解假想蛋白SPD-0873的功能,通過(guò)熒光定量PCR比較缺陷菌和野生菌中幾種主要的毒力因子的表達(dá)差異,探索spd-0873基因影響細(xì)菌毒力的機(jī)制。 結(jié)果通過(guò)生物信息學(xué)分析可知, spd-0873的編碼產(chǎn)物含有β-1,4-N-乙酰胞壁酸糖苷酶結(jié)構(gòu)域,該酶屬于糖基水解酶25家族,可以水解細(xì)胞壁中N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰葡糖按(NAG)之間的β-1,4糖苷鍵。溶菌酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,卵清溶菌酶和SPD-0873重組蛋白均可使底物PNP-(GlcNAc)5釋放出游離的對(duì)硝基苯酚,OD405nm吸光度值分別為1.166和0.792;小鼠體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)顯示,野生菌和缺陷菌的死亡時(shí)間分別是感染后11h和36h,缺陷菌毒力較野生菌顯著降低(P0.001);體外生長(zhǎng)曲線顯示,缺陷菌的增殖能力較之野生菌顯著降低;透射電鏡顯示:體外培養(yǎng)缺陷菌莢膜丟失,感染小鼠后莢膜可恢復(fù),而野生菌體外、體內(nèi)均有莢膜;缺陷菌體外粘附能力較之野生菌顯著增強(qiáng)(P0.01);同野生菌比較,溶血素(pneumolysin, ply)、神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, nanA)在缺陷菌中表達(dá)量分別降低了1.2倍、1.26倍,而鏈球菌表面粘附素A(pneumococcal surface adhesion A, psaA)表達(dá)量增加3倍。 結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示假想蛋白SPD-0873具有一定的溶菌酶活性;同時(shí)spd-0873基因缺陷菌在小鼠體內(nèi)毒力顯著降低,并影響肺炎鏈球菌的生長(zhǎng)增殖、莢膜形成、粘附能力及毒力因子的表達(dá),是一種新的毒力因子。
[Abstract]:Background because of the increase of antibiotic resistance rate of Streptococcus pneumoniae S.pn) and the defect of the vaccine itself, the prevention and treatment of Streptococcus pneumoniae S.pn. has become a very difficult problem.In order to solve this problem thoroughly, we should go deep into its pathogenic mechanism and provide theoretical basis for the development of new drugs and vaccines.In previous studies, we screened out in vivo vivo-induced gene and ivi gene associated with virulence of Streptococcus pneumoniae by in vivo expression technique.Through bioinformatics analysis of these genes, we found that the product encoded by spd-0873 gene, the hypothetical protein SPD-0873 and the LytC in Streptococcus pneumoniae, had similar functional domain, and the biofilm formation ability of the negative mutant strain LytC was decreased.So we speculate that it is a new virulence factor that functions like LytC.Objective to identify the biological function of hypothetical protein SPD-0873 and explore the mechanism of spd-0873 gene affecting bacterial virulence.Methods PNP-(GlcNAc)5 assay was used to determine whether the protein SPD-0873 had lysozyme function, long flanking homology polymerase chain reaction was used to prepare spd-0873 deficient bacteria.The virulence of defective bacteria was compared with that of wild bacteria in mice, and the ability of capsule synthesis in vivo and in vitro was observed by describing the growth curve of bacteria, transmission electron microscope, capsule staining, and so on.To further understand the function of hypothetical protein SPD-0873, the mechanism of spd-0873 gene affecting bacterial virulence was explored by comparing the expression differences of several main virulence factors between defective bacteria and wild bacteria by fluorescence quantitative PCR.Results according to the bioinformatics analysis, the encoding product of spd-0873 contained 尾 -1C 4-N acetylcyticosidase domain, which belonged to the glycosylhydrolase 25 family.The 尾 -1C 4 glucoside bond between N- acetyl cytosolic acid (NAM) and N-acetyl glucosamine (NAG) in cell wall can be hydrolyzed.The death time of wild bacteria and deficient bacteria were 11 h and 36 h after infection respectively, the virulence of defective bacteria was significantly lower than that of wild bacteria, and the growth curve in vitro showed that the proliferative ability of defective bacteria was significantly lower than that of wild bacteria.Transmission electron microscopy (TEM) showed that the capsule of defective bacteria was lost in vitro, the capsule recovered after infection in mice, while the capsule of wild bacteria was found in vivo, the adhesion ability of defective bacteria in vitro was significantly enhanced than that of wild bacteria, and compared with wild bacteria, the in vitro adhesion of defective bacteria was significantly higher than that of wild bacteria, while that of wild bacteria was higher than that of wild bacteria.The expression of hemolysin, plyosin, neuraminidase and neuraminidase were decreased by 1.2-fold and 1.26 times, respectively, while the expression of A(pneumococcal surface adhesion A (psaA-1) increased by three times.Conclusion the results suggest that the hypothetical protein SPD-0873 has a certain lysozyme activity, and that the virulence of spd-0873 gene deficient bacteria in mice is significantly decreased, and the growth and proliferation of Streptococcus pneumoniae, capsule formation, adhesion ability and the expression of virulence factor are also affected.It is a new virulence factor.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R378.14

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