本文選題：基因芯片　切入點(diǎn)：醫(yī)學(xué)RNA病毒　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年博士論文

【摘要】： 在人類傳染病中,70%以上都是由病毒引起的,即病毒性傳染病。目前已知的病毒有5400多種,其中與人類疾病相關(guān)的約有400多種。而在人類致病病毒即醫(yī)學(xué)病毒中,RNA病毒占總數(shù)的80%以上,大部分烈性病毒性傳染病由RNA病毒引起,如絲狀病毒屬中的埃博拉病毒及馬爾堡病毒、沙粒病毒屬中的拉沙熱病毒、甲病毒屬中的委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒等。因此,建立高通量、快速篩查及鑒定未知RNA病毒的技術(shù)平臺具有重要的意義�；蛐酒夹g(shù)是一種大規(guī)模集成的固相雜交技術(shù),其基本原理是核酸分子雜交,即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)配對、變性和復(fù)性的原理,以大量已知序列的oligo、cDNA或基因片段作探針,檢測樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ),然后經(jīng)過一定的檢測系統(tǒng)對雜交信號進(jìn)行檢測,并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一雜交信號數(shù)據(jù)進(jìn)行定性、定量分析和處理,從而迅速得出待測品的基因序列及表達(dá)的信息。 本研究的目的是建立能夠在屬水平對醫(yī)學(xué)RNA病毒進(jìn)行快速篩查的基因芯片技術(shù),在出現(xiàn)新(突)發(fā)傳染病疫情或公共衛(wèi)生事件時(shí),能利用該芯片,快速將病毒性病原體篩查到屬水平,為進(jìn)一步進(jìn)行病原體的分離培養(yǎng)、鑒定及傳染病疫情的防控提供有意義的參考。本研究的設(shè)計(jì)思路是在屬水平設(shè)計(jì)醫(yī)學(xué)RNA病毒的寡核苷酸(oligo)探針,針對每個(gè)病毒屬設(shè)計(jì)10條左右探針,使探針序列能覆蓋該病毒屬中所有已知的病毒株,因此可將該芯片用于對目前已知的RNA病毒進(jìn)行屬水平的快速篩查。另外,由于同一病毒屬內(nèi)不同病毒株之間雖然堿基序列不完全相同,但存在相當(dāng)程度的同源性,因此,通過采用較長的oligo探針(63mer),允許在雜交時(shí)模板與探針之間存在一定的堿基錯(cuò)配,而任何一種新發(fā)或未知病毒都必然與某個(gè)病毒屬中的已知病毒存在一定的同源性,因此,利用該芯片也可對目前未知的新發(fā)病毒性病原體進(jìn)行快速分類。 本課題的主要研究結(jié)果如下: 1.醫(yī)學(xué)RNA病毒屬水平oligo探針的設(shè)計(jì)及生物信息學(xué)驗(yàn)證 依據(jù)國際病毒分類委員會2005年發(fā)布的第八次分類報(bào)告中的病毒分類數(shù)據(jù)庫(http://phene.cpmc.columbia.edu/ICTV/index.htm)及NCBI的病毒分類數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.gov/Taxomomy/Browser/Viruses),挑選對人類致病的RNA病毒,選取14個(gè)病毒科、32個(gè)病毒屬的RNA病毒作為本課題擬檢測的醫(yī)學(xué)RNA病毒。然后從GenBank病毒數(shù)據(jù)庫中下載擬檢測病毒的基因組序列。如果一個(gè)病毒屬已測基因組全序列"g10條的,下載已登錄的所有病毒基因組全序列。如果一個(gè)病毒屬已測基因組全序列"f10條的,除下載已登錄的全序列之外,同時(shí)下載其它部分測序的序列。對于分段RNA病毒,需要下載所有片段的序列。共獲得各種序列約15萬條,用于醫(yī)學(xué)RNA病毒屬水平oligo探針的設(shè)計(jì)。利用Arraydesigner 4.0等軟件并參考國外已發(fā)表的病毒屬及種的oligo探針序列,針對每個(gè)病毒屬設(shè)計(jì)10～30條探針,使探針序列能覆蓋該病毒屬的所有已知病毒株。探針長度均為63mer,Tm值為75±5℃,使所有探針盡量具有相近的雜交動(dòng)力學(xué)參數(shù)。同時(shí)遵循oligo探針的其它設(shè)計(jì)原則,共設(shè)計(jì)了314條病毒屬水平oligo探針及314條互補(bǔ)序列探針。雜交系統(tǒng)陽性對照探針是針對丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)基因組而設(shè)計(jì),探針長度為63mer,共設(shè)計(jì)10條陽性對照探針。本課題中共設(shè)計(jì)了oligo探針638條。利用生物信息學(xué)技術(shù),通過與所有已測序的病毒序列進(jìn)行BLAST比較,進(jìn)行了探針的特異性驗(yàn)證,包括病毒屬內(nèi)序列同源性及屬間序列的特異性。 2.oligo探針的篩選與剔除及基因芯片雜交條件的優(yōu)化 由于影響基因芯片雜交結(jié)果的因素很多,因此,在利用生物信息學(xué)方法完成探針特異性的驗(yàn)證之后,進(jìn)一步利用實(shí)驗(yàn)手段對探針的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。具體方法是在各個(gè)病毒屬中選擇一種病毒,設(shè)計(jì)該病毒的特異PCR擴(kuò)增引物,使擴(kuò)增片段中包含至少一條針對該病毒屬的oligo探針序列。然后通過分析特異PCR產(chǎn)物與基因芯片的雜交結(jié)果,考核所設(shè)計(jì)的探針的特異性,并對特異性差的探針予以剔除。結(jié)果證實(shí)大多數(shù)探針具有良好的雜交特異性,但也有一些探針出現(xiàn)非特異陽性雜交信號,表明其特異性較差,通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證共剔除了18條特異性較差的探針。另外,以日本乙型腦炎病毒作為模擬未知標(biāo)本,采用錨定隨機(jī)引物PCR法從病毒的培養(yǎng)上清中擴(kuò)增樣本核酸,通過與基因芯片雜交,進(jìn)行了芯片點(diǎn)樣后封閉、芯片雜交條件及雜交液鹽離子濃度的優(yōu)化。結(jié)果顯示,點(diǎn)樣后經(jīng)過NaBH4封閉的雜交效果更好,可有效降低背景熒光。通過比較雜交溫度分別為36℃、39℃、42℃、45℃、48℃時(shí)的基因芯片雜交結(jié)果,證實(shí)42℃是本芯片的最適雜交溫度。通過比較雜交時(shí)間分別為2 hr、6 hr、8 hr及過夜雜交的結(jié)果,證實(shí)過夜雜交是本芯片的最適雜交時(shí)間。通過比較雜交液中甲酰胺濃度分別為25%、33%、40%、50%和60%時(shí)的雜交效果,證實(shí)50%是本芯片的最適甲酰胺濃度。 3.標(biāo)本前處理方法的探索及未知病毒靶核酸擴(kuò)增方法的建立 宿主細(xì)胞基因組成分的干擾及如何對未知病毒核酸進(jìn)行有效擴(kuò)增是制約高通量病毒基因芯片技術(shù)發(fā)展的主要因素。本研究對標(biāo)本前處理方法及未知病毒核酸的擴(kuò)增方法進(jìn)行了探索與比較。結(jié)果表明,在提取病毒RNA之前,對標(biāo)本進(jìn)行離心、過濾及DNA酶I/RNA酶的雙酶預(yù)處理等步驟可有效降低宿主細(xì)胞基因組成分對芯片雜交結(jié)果的干擾。而對于如何有效擴(kuò)增未知病毒核酸,從RNA的逆轉(zhuǎn)錄及序列非依賴性擴(kuò)增兩個(gè)步驟進(jìn)行了比較。針對RNA的逆轉(zhuǎn)錄步驟,比較了病毒偏性引物逆轉(zhuǎn)錄法、隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄法及錨定隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄法,結(jié)果表明病毒偏性引物逆轉(zhuǎn)錄法更能提高病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄水平。針對序列非依賴性擴(kuò)增,比較了PVA引物擴(kuò)增法、多重置換擴(kuò)增法、錨定隨機(jī)引物擴(kuò)增法及限制性顯示PCR擴(kuò)增法,證實(shí)采用錨定隨機(jī)引物法,并以多重置換擴(kuò)增法作為補(bǔ)充進(jìn)行病毒核酸的擴(kuò)增,可實(shí)現(xiàn)對未知病毒核酸的有效及均衡擴(kuò)增,提高基因芯片檢測的敏感性及特異性。 4.基因芯片篩查技術(shù)的建立 綜合以上的研究結(jié)果,初步建立了醫(yī)學(xué)RNA病毒屬水平篩查基因芯片技術(shù),并對基因芯片的檢測敏感性及特異性進(jìn)行了考核與驗(yàn)證。以日本乙型腦炎病毒為模擬未知標(biāo)本,證實(shí)本芯片對該病毒培養(yǎng)上清的檢測敏感性約為100個(gè)病毒粒子。然后分別利用已知病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清、新分離未知標(biāo)本的培養(yǎng)上清及模擬臨床標(biāo)本,對本芯片進(jìn)行了檢測特異性的考核。結(jié)果顯示,對已知病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清、新分離未知標(biāo)本的培養(yǎng)上清,本芯片均獲得了特異性較好的篩查結(jié)果。對于模擬臨床標(biāo)本,雖然雜交結(jié)果中存在一些非特異信號,但陽性信號絕對值最高的是待檢測標(biāo)本,因此本芯片也能對模擬臨床標(biāo)本進(jìn)行快速篩查。 總之,本研究首先在醫(yī)學(xué)RNA病毒屬水平設(shè)計(jì)oligo探針,對探針的特異性進(jìn)行了生物信息學(xué)及實(shí)驗(yàn)手段的驗(yàn)證,剔除了部分特異性差的探針。然后對基因芯片雜交條件進(jìn)行了優(yōu)化,選擇了針對本芯片的最適雜交溫度、雜交時(shí)間及鹽離子濃度。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行了標(biāo)本前處理方法的摸索及未知病毒核酸擴(kuò)增方法的優(yōu)化,初步建立了醫(yī)學(xué)RNA病毒屬水平篩查基因芯片技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù),可對細(xì)胞培養(yǎng)上清中的未知病毒進(jìn)行屬水平的快速篩查。在出現(xiàn)傳染病疫情時(shí),多數(shù)時(shí)候通過觀察病原體對抗生素的敏感性并結(jié)合臨床癥狀等,可快速判定病原體是否為病毒。但即使是在敏感細(xì)胞中觀察到了細(xì)胞病變,由于是未知病毒,對病原體的鑒定仍是一項(xiàng)非常困難的工作。本研究為解決該問題提供了一種高通量的快速篩查技術(shù)。將未知病毒快速篩查到屬水平后,可能利用病毒屬通用PCR并結(jié)合序列測定技術(shù)等,實(shí)現(xiàn)對未知病毒的最終鑒定。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R346

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本文編號：1681871