本文選題：O157:H7　切入點(diǎn)：Z3672　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2010年碩士論文

【摘要】： 病原微生物的流行對人類健康構(gòu)成了重大威脅,研究病原微生物與宿主相互作用的分子基礎(chǔ),對預(yù)防與治療感染性疾病、改善人類健康具有重要意義,它也一直是醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題之一。生物信息學(xué)作為一門新興學(xué)科已廣泛地滲透到生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域,發(fā)揮著巨大作用。隨著越來越多的全基因組序列的測定完成,對基因組序列進(jìn)行比較分析,探索序列結(jié)構(gòu)與病原微生物致病能力間關(guān)系的比較基因組學(xué)也應(yīng)運(yùn)而生,為病原微生物學(xué)的研究注入了新的活力。在前期研究中,我們應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的蛋白家族(FlxA-like proteins),分析表明該蛋白家族可能參與細(xì)菌與宿主相互作用,并且可能是具有III型分泌系統(tǒng)的致病菌的重要效應(yīng)蛋白(毒力蛋白)。 腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E. coli,EHEC)O157:H7是常見的腸道致病菌,感染該菌可引起腹瀉、出血性結(jié)腸炎,溶血性尿毒綜合征及血栓形成性血小板減少性紫癜等嚴(yán)重并發(fā)癥,嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡,致死率達(dá)5%～10%。1982年,Riley等報(bào)道了由O157:H7引起的出血性結(jié)腸炎的暴發(fā)流行,這也是把O157:H7確認(rèn)為嚴(yán)重致病菌的首次報(bào)道。隨后在加拿大、日本、英國、澳大利亞等地發(fā)生了多起該菌的感染流行。1999年,在我國安徽、江蘇兩省曾暴發(fā)流行O157感染性腹瀉,患者超過2萬人,死亡177人,流行時(shí)間7個(gè)月,可能是迄今為止世界上流行規(guī)模最大的一次。我國已將EHEC列為21世紀(jì)可能對國人衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一。由于O157:H7的感染呈現(xiàn)暴發(fā)流行趨勢,感染后對人體有強(qiáng)烈的致病性與致死性,而且抗生素治療可能會加劇病情,因此,它已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題。O157培養(yǎng)容易、傳播途徑多樣,感染性很強(qiáng),100 CFU(菌落形成單位)即可致病,且多數(shù)病癥較為嚴(yán)重。它也被美國疾病控制中心(CDC)列為B類生物恐怖病原體嚴(yán)加防范。通過近三十多年的研究,我們對O157:H7的致病機(jī)制已經(jīng)有了初步認(rèn)識,但尚未完全闡明,了解感染的致病機(jī)理對預(yù)防和治療由該菌引起的流行性疾病具有重要的理論指導(dǎo)意義。 我們應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測發(fā)現(xiàn)的新蛋白家族(FlxA-like proteins)成員中存在Z3672蛋白,它是一個(gè)來源于O157:H7的假想蛋白,根據(jù)預(yù)測信息我們推測它很可能是具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)的致病菌重要的效應(yīng)蛋白(毒力蛋白)。因此,通過對O157:H7 Z3672蛋白的研究,有望發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)分子,從而推進(jìn)O157:H7致病的分子基礎(chǔ)研究工作,為進(jìn)一步了解FlxA-like蛋白家族在細(xì)菌與宿主相互作用過程中所發(fā)揮的功能奠定基礎(chǔ)。 本研究通過Red重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了O157:H7 z3672缺失突變株。首先經(jīng)過PCR、酶切、連接等步驟,構(gòu)建了兩端同源序列分別約500bp的z3672基因長同源臂打靶片段,該片段連接在pET-24a載體上。然后通過pKOBEG質(zhì)粒介導(dǎo)的Red重組,使電擊轉(zhuǎn)化入菌體內(nèi)部的同源臂打靶片段與O157:H7基因組序列進(jìn)行了同源重組,經(jīng)過抗性篩選、PCR鑒定以及測序分析,成功獲得了O157:H7 z3672缺失突變體。通過Real-Time PCR實(shí)驗(yàn),針對z3672基因在野生株是否轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了檢測,比較O157:H7野生株與O157:H7 z3672缺失突變株中z3672基因的轉(zhuǎn)錄差異,并且證明了在O157:H7野生株中z3672基因存在轉(zhuǎn)錄活性。 在獲得了O157:H7 z3672缺失突變株后,主要對z3672基因的功能進(jìn)行了初步研究。一方面,利用雙向電泳以及蛋白質(zhì)譜鑒定的方法,對O157:H7野生株和O157:H7 z3672缺失突變株進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。研究表明,在O157:H7 z3672缺失突變株中,外膜蛋白A(OmpA)的表達(dá)量升高。通過Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)從基因的轉(zhuǎn)錄水平對以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果證明,Real-Time PCR與雙向電泳結(jié)果一致,因此,在O157:H7中,z3672基因與ompA(外膜蛋白A)基因存在某種聯(lián)系,敲除z3672基因可以提高外膜蛋白A的表達(dá)水平。另一方面,通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),比較O157:H7野生株與O157:H7 z3672缺失突變株對真核細(xì)胞(HeLa)造成的A/E損傷是否存在差異。利用細(xì)胞骨架蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn),觀察O157:H7野生株與O157:H7 z3672缺失突變株分別粘附HeLa細(xì)胞后,細(xì)胞骨架蛋白Actin,Keratin,Tubulin改變差異。實(shí)驗(yàn)表明,敲除z3672基因前后, O157:H7對細(xì)胞骨架蛋白Actin,Keratin,Tubulin改變差異并不明顯。這也說明,Z3672蛋白不是O157:H7中影響真核細(xì)胞骨架改變的核心因子。 在細(xì)胞骨架肌動蛋白熒光染色實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):利用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)的O157:H7感染HeLa細(xì)胞后可以形成明顯的肌動蛋白聚集現(xiàn)象。于是對這一現(xiàn)象進(jìn)行了初步探索。利用不同的培養(yǎng)基條件(LB,DMEM,DMEM含10% FBS,DMEM含終濃度為25m mol/L HEPES)培養(yǎng)O157:H7并對其生長狀態(tài),粘附HeLa細(xì)胞,HeLa細(xì)胞骨架肌動蛋白聚集狀況以及蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明,雖然在DMEM含10% FBS中生長最慢,但是O157:H7粘附性以及對肌動蛋白聚集的能力是最強(qiáng)的。由于O157:H7對真核細(xì)胞的A/E損傷主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面,一是其對真核細(xì)胞的粘附作用;二是其對真核細(xì)胞的細(xì)胞骨架肌動蛋白聚集能力。因此,以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明了利用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的O157:H7對真核細(xì)胞的A/E損傷能力增強(qiáng),進(jìn)而其致病能力也增強(qiáng)了。 本研究構(gòu)建了O157:H7 z3672缺失突變株,證明了z3672基因的缺失可以上調(diào)外膜蛋白A的表達(dá),并且證明該基因不是影響真核細(xì)胞骨架改變的核心因子,這些為進(jìn)一步研究Z3672蛋白及FlxA-like蛋白家族在細(xì)菌與宿主相互作用過程中所發(fā)揮的功能奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),利用DMEM(10% FBS)培養(yǎng)的O157:H7與宿主細(xì)胞體外作用,可以使O157:H7對宿主細(xì)胞A/E損傷的能力增強(qiáng),但具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究,這也為更全面地了解O157:H7的致病機(jī)制提供了新思路。
[Abstract]:The epidemic of pathogenic microorganism constitutes a major threat to human health , and studies the molecular basis of the interaction between pathogenic microorganism and host . It has important significance for preventing and treating infectious diseases and improving human health .



Enterohaemorrhagic E . coli ( EHEC ) 157 : H7 is a common pathogen of intestinal tract infection .



Therefore , it is hopeful to find a new type III secretion system effector molecule by studying the protein of 157 : H7 Z3672 . Therefore , it is hopeful to find a new type III secretion system effector molecule to advance the molecular base research work of 157 : H7 , which lays the foundation for further understanding the function of the FlG - like protein family in the interaction of bacteria and host .



In this study , we have successfully constructed a mutant strain 157 : H7 z3672 by Red recombination system . First of all , we constructed z3672 gene long homologous arm targeting fragment of 500 bp homologous sequences by PCR , enzyme digestion , ligation and so on .



On the one hand , the expression of outer membrane protein A ( OmpA ) was analyzed by means of two - way electrophoresis and protein spectrum identification . The results showed that the expression of outer membrane protein A ( OmpA ) was increased by using two - way electrophoresis and protein spectrum identification .



A preliminary study was conducted in the cytoskeletal muscle actin fluorescence staining experiment . The results showed that : 1 % FBS , 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS and DMEM containing 10 % FBS was the strongest .



It is proved that the deletion of z3672 gene can up - regulate the expression of outer membrane protein A and prove that the gene is not the core factor affecting the transformation of eukaryotic cells .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R378.21

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉徐兵;周圍;李玉霞;張京生;凌焱;胡偉;張書祥;張部昌;段海清;梁龍;;用Red系統(tǒng)敲除大腸桿菌O157∶H7的ecs4553以及ecs4563基因[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2007年02期

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本文編號：1679849