本文選題：蜂毒因子　切入點(diǎn)：陽離子聚合物　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年碩士論文

【摘要】： 近年來,陽離子聚合物載體是基因治療的一個(gè)重要研究方向。與脂質(zhì)體相比,陽離子聚合物具有毒性低,生物相容性好的優(yōu)點(diǎn)。其中,聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)是目前研究最多的陽離子聚合物載體。PEI能結(jié)合質(zhì)粒DNA并將其濃縮為納米級(jí)復(fù)合物,在體外基因轉(zhuǎn)染和動(dòng)物體內(nèi)基因治療研究中均顯示出良好的轉(zhuǎn)染效率。然而在一些細(xì)胞系中其轉(zhuǎn)染效率仍明顯低于以Lipofectamine 2000為代表的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。陽離子脂質(zhì)體的分子中有帶正電荷的極性頭和親脂的尾,其親脂的尾部能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)染試劑穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并從內(nèi)涵體釋放;而陽離子聚合物則無親脂結(jié)構(gòu),只能依靠“質(zhì)子海綿”效應(yīng)脹破內(nèi)涵體,推測是它從內(nèi)涵體中釋放的能力較差的原因之一。 為克服陽離子聚合物的不足,人們發(fā)現(xiàn)通過引入穿膜肽與之交聯(lián)的方法可進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率。其中蜂毒因子Melittin是一種穿膜能力較強(qiáng)的穿膜肽,長26個(gè)氨基酸(GIGAVLKVLTTGLPA LISWIKRKRQQ),其N端1-20位為帶負(fù)電的氨基酸形成疏水性的尾部,N端21-24位為帶正電荷氨基酸形成的頭部,與脂類化合物的結(jié)構(gòu)非常相似。Ogris等將Melittin疏水性的尾部與PEI交聯(lián),能夠在人宮頸癌HeLa細(xì)胞中有效增強(qiáng)PEI的基因轉(zhuǎn)染效率。 在以往研究中,我們發(fā)現(xiàn)Melittin疏水尾部能夠增強(qiáng)PEI介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率。本研究擬進(jìn)一步探討使用蜂毒短肽疏水性尾部增加支鏈聚乙烯亞胺(BPEI)在HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率的機(jī)理。我們合成了Melittin的疏水性尾部20個(gè)肽(命名為MT20);使用血紅蛋白釋放實(shí)驗(yàn)檢測其穿透細(xì)胞膜的能力;將MT20與支鏈聚乙烯亞胺(BPEI,25KD)按一定比例混合后,與EGFP-N1質(zhì)粒DNA混合,通過DNA凝膠遲滯實(shí)驗(yàn)檢測MT20對BPEI結(jié)合質(zhì)粒DNA的能力;使用Brookhaven Zeta PALS動(dòng)態(tài)光散射儀器檢測形成MT20/BPEI/DNA三聚體的表面電勢和顆粒大小;將三聚體加入HeLa等細(xì)胞中觀察其基因轉(zhuǎn)染效率;以MTT法檢測基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示低濃度的MT20不會(huì)引起紅細(xì)胞溶血反應(yīng),隨著MT20濃度的提高,紅細(xì)胞在PBS(pH7.2)和PCS (pH5.6)緩沖液中的溶血率逐步升高,當(dāng)MT20的濃度為20.0μmol/L時(shí),在兩種緩沖液中的溶血率分別為82%和59%,提示在中性和酸性條件下,該疏水片段均可穿透細(xì)胞膜導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血。加入MT20后,BPEI/DNA復(fù)合物的凝膠電泳行為未發(fā)生變化,說明加入MT20不會(huì)影響B(tài)PEI與DNA的結(jié)合能力。MT20/BPEI/DNA的的表面電勢有所下降,復(fù)合物顆粒變化不大,而當(dāng)MT20/BPEI比例為2:1時(shí),粒徑有所增大,但總體來說表面電荷和粒徑大小均符合基因轉(zhuǎn)染的要求。使用96孔板進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染,當(dāng)BPEI量為75 ng/孔時(shí),加入MT20可以使GFP的表達(dá)水平得到不同程度的增高,當(dāng)MT20的量為112.5 ng/孔時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高,其GFP的熒光強(qiáng)度達(dá)4821.3 RFU,大約為單獨(dú)使用BPEI時(shí)的4倍,略高于Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染后的4719 RFU。表明MT20能夠顯著增加BPEI在HeLa等細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)染效率。在細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)中,單獨(dú)使用BPEI進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞存活率為73.81%,加入MT20后可以降低BPEI的用量;在最適條件下,其細(xì)胞存活率達(dá)到94.44%,說明MT20不僅可以提高BPEI的轉(zhuǎn)染效率,而且可以降低基因轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。 HeLa細(xì)胞是生物學(xué)實(shí)驗(yàn),特別是腫瘤生物學(xué)研究最常用的模式細(xì)胞之一,其應(yīng)用范圍非常廣泛。由于BPEI在HeLa細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率很低,大約為5-10%之間。因此本研究的另一個(gè)目的是在MT20的增強(qiáng)作用下,將針對ATR基因的siRNA表達(dá)載體較為高效地導(dǎo)入HeLa細(xì)胞,觀察siRNA對腫瘤細(xì)胞ATR基因表達(dá)的抑制效果,并進(jìn)一步分析ATR基因表達(dá)水平抑制之后,細(xì)胞對烷化劑藥物的敏感性變化。結(jié)果顯示MT20與陽離子聚合物BPEI混合體可以有效將siRNA表達(dá)載體導(dǎo)入HeLa細(xì)胞內(nèi),Western印跡實(shí)驗(yàn)顯示未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞可正常表達(dá)ATR蛋白,而siRNA+細(xì)胞幾乎沒有ATR條帶,提示siRNA明顯抑制ATR基因表達(dá)水平。藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞和siRNA+HeLa細(xì)胞均對鹽酸尼莫司汀(ACNU)有很強(qiáng)的抗性,單獨(dú)使用ACNU,半數(shù)抑制劑量(ID50)均超過100?g/ml,而siRNA+ HeLa對ACNU的抗性較對照HeLa細(xì)胞更強(qiáng)。鏈脲菌素(STZ)處理能夠提高腫瘤細(xì)胞對ACNU的敏感性,當(dāng)預(yù)先以10 mmol/L的STZ抑制細(xì)胞MGMT活性,然后使用ACNU處理細(xì)胞時(shí),細(xì)胞對ACNU的敏感性大幅提高, ID50均10?g/ml,siRNA+ HeLa對ACNU的更為敏感一些。研究結(jié)果表明針對ATR的shRNA能夠影響HeLa細(xì)胞對烷化劑藥物的敏感性,對研究烷化劑的作用機(jī)理具有一定的意義。 總之,本研究表明MT20具有與Melittin全長相當(dāng)?shù)拇┩讣?xì)胞膜的活性,可以作為一種良好的增強(qiáng)劑,可在難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中增加陽離子聚合物的基因轉(zhuǎn)染效率,為進(jìn)一步進(jìn)行基因功能研究奠定基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李擁軍,管珩,王宗立;血管再狹窄的基因治療[J];中國動(dòng)脈硬化雜志;2001年01期

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本文編號(hào)：1664228