本文選題：自然流產(chǎn)　切入點(diǎn)：蛻膜　出處：《山東大學(xué)》2008年博士論文

【摘要】： 妊娠的成功恰恰依賴于母胎免疫耐受狀態(tài),但其中的機(jī)制至今尚不十分清楚。妊娠早期母胎界面成分及其構(gòu)成的特殊的免疫微環(huán)境對(duì)母胎免疫耐受的維持至關(guān)重要。位于母胎界面的蛻膜被認(rèn)為是一個(gè)免疫特赦組織,妊娠早期大量白細(xì)胞在此選擇性聚集,其中最主要的是蛻膜NK(decidual natural killer,dNK)細(xì)胞,約占淋巴細(xì)胞總量的70-80%,另外還有樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)、單核巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞。這些免疫活性細(xì)胞在局部組織微環(huán)境的調(diào)控下能夠獲得特異性的表型和功能,從而決定局部免疫反應(yīng)的取向-免疫應(yīng)答或免疫耐受形成。 研究報(bào)道吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)廣泛表達(dá)于妊娠早期的母胎界面,它是肝臟以外唯一可催化色氨酸(L-tryptophan)分子中吲哚環(huán)氧化裂解,從而經(jīng)犬尿氨酸(L-kynurenine)途徑代謝的限速酶,調(diào)控色氨酸代謝。IDO的活性表達(dá)誘導(dǎo)形成“色氨酸耗竭微環(huán)境”,使細(xì)胞處于一種色氨酸饑餓狀態(tài),通過抑制T細(xì)胞及NK細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)致耐受性DCs形成等多種機(jī)制在免疫反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明妊娠時(shí)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的IDO能夠抑制母體T淋巴細(xì)胞反應(yīng),從而保護(hù)胎兒對(duì)抗母體的排斥反應(yīng),而體內(nèi)試驗(yàn)加入IDO抑制劑1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan,1-MT)可導(dǎo)致同種異基因胎兒排斥反應(yīng)�？梢娬５腎DO表達(dá)和活性是維持妊娠所必需的,然而母胎界面IDO表達(dá)對(duì)蛻膜NK細(xì)胞及DCs的影響還不清楚。 蛻膜NK細(xì)胞具有獨(dú)特的表型和功能特點(diǎn),是妊娠早期一道獨(dú)特的風(fēng)景。對(duì)其表型分析結(jié)果顯示:90%的uNK細(xì)胞為CD56~(bright)CD16~-,而90%的外周血NK(peripheral-blood NK,pNK)細(xì)胞為CD56~(dim)CD16~+。dNK細(xì)胞是妊娠早期母胎界面數(shù)量最多的淋巴細(xì)胞,主要分布于母體與胚胎接觸的底蛻膜并與侵入的滋養(yǎng)層細(xì)胞密切接觸,它可能是母體直接識(shí)別胎兒抗原的免疫細(xì)胞,在維持母胎免疫平衡和促進(jìn)早期胎盤生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。dNK細(xì)胞功能狀態(tài)是影響母胎界面免疫調(diào)控的關(guān)鍵因素,而NK細(xì)胞表面活化性受體或抑制性受體激活后發(fā)出的活化性信號(hào)或抑制性信號(hào)的平衡調(diào)節(jié)決定著dNK細(xì)胞的功能狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)dNK細(xì)胞高表達(dá)能夠介導(dǎo)dNK細(xì)胞殺傷功能的自然殺傷活性受體(naturalcytotoxicity receptors,NCRs),如NKp46、NKp44、NKp30和NKG2D,另外還高表達(dá)穿孔素和顆粒酶。這些研究提示dNK細(xì)胞具有潛在的殺傷活性。值得注意的是正常妊娠時(shí)dNK殺傷活性較低。但在某些病理妊娠如復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)時(shí),這些活化性受體的表達(dá)和功能發(fā)生了變化,從而使dNK細(xì)胞殺傷功能增強(qiáng)進(jìn)而導(dǎo)致妊娠排斥�？梢�,正常妊娠時(shí)dNK細(xì)胞可能受到母胎界面免疫微環(huán)境的調(diào)控而維持低殺傷活性,但其機(jī)制還不清楚。最近有報(bào)道IDO的代謝產(chǎn)物犬尿氨酸能夠特異性抑制人外周血來源的NK細(xì)胞表面自然殺傷活性受體NKG2D和NKp46的表達(dá),從而抑制NK細(xì)胞的殺傷活性,并且還能夠減少NK細(xì)胞IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子的分泌。另有研究報(bào)道犬尿氨酸還能夠抑制NK細(xì)胞增殖。然而母胎界面活性表達(dá)的IDO對(duì)dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞表型和功能的影響還不清楚。推測(cè)IDO可以調(diào)控dNK細(xì)胞表面活化性受體的表達(dá)并影響其殺傷活性功能,從而誘導(dǎo)免疫耐受。 新近,蛻膜DCs亞群被認(rèn)為在維持母胎免疫調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DCs是功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞,不同的DCs亞群和表型特點(diǎn)可能控制免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和性質(zhì),從而能夠決定局部免疫反應(yīng)的取向-免疫應(yīng)答或免疫耐受形成。DCs功能受局部組織微環(huán)境的調(diào)控并與其表面抗原表達(dá)譜有關(guān)。大量研究證實(shí)DCs可以通過上調(diào)IDO表達(dá)而誘導(dǎo)免疫耐受。有研究報(bào)道蛻膜Lin~-HLA-DR~+DCs能夠表達(dá)IDO。這些研究提示母胎界面IDO表達(dá)參與蛻膜DCs功能的調(diào)控。但是由于缺乏特異性標(biāo)志物以及數(shù)量較少,以往對(duì)對(duì)蛻膜DCs的研究受到極大的限制,目前蛻膜DC亞群的分布及其表型特點(diǎn)還不十分清楚。而研究妊娠早期蛻膜組織中DCs亞群及其表型特點(diǎn),將為進(jìn)一步研究IDO對(duì)蛻膜DCs功能的影響提供理論基礎(chǔ)。 本研究分為三部分,第一部分主要探討妊娠早期母胎界面IDO表達(dá)情況以及與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的關(guān)系;第二部分探討IDO是否調(diào)控dNK細(xì)胞表面殺傷活性受體表達(dá)和殺傷活性等功能;第三部分是利用新近發(fā)現(xiàn)的BDCA標(biāo)志來檢測(cè)早孕期蛻膜組織中DCs亞群及其表型特點(diǎn),并進(jìn)一步分析DCs亞群的數(shù)量隨孕周變化的特點(diǎn)。本研究有助于深入理解母胎免疫耐受調(diào)節(jié)機(jī)制,以期為母胎免疫失衡相關(guān)妊娠并發(fā)癥的診治提供新的策略。 第一部分妊娠早期母胎界面及滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo中IDO表達(dá)與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的關(guān)系 目的:探討人妊娠早期母胎界面及人絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo中IDO的表達(dá)與RSA的關(guān)系。 方法:(1)免疫組化法檢測(cè)正常妊娠早期和RSA患者絨毛和蛻膜組織中IDO蛋白質(zhì)表達(dá);定量RT-PCR法檢測(cè)兩組絨毛和蛻膜組織中IDO mRNA的表達(dá)。(2)絨毛組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人妊娠早期絨毛組織,高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)培養(yǎng)上清中有無犬尿氨酸,并分析IFN-γ對(duì)IDO功能活性的影響。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HTR-8/SVneo細(xì)胞中IDO蛋白質(zhì)表達(dá);定量RT-PCR法檢測(cè)IDOmRNA表達(dá)水平;HPLC法檢測(cè)培養(yǎng)上清中有無犬尿氨酸,并分析IFN-γ對(duì)IDO表達(dá)水平及功能活性的影響。 結(jié)果:(1)免疫組化法發(fā)現(xiàn)IDO主要表達(dá)于絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞以及蛻膜腺上皮細(xì)胞,少數(shù)病例可見IDO主要表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞,而絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞未見有表達(dá);IDO mRNA在絨毛組織和蛻膜組織中均有表達(dá),(2)絨毛組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人妊娠早期絨毛,方法簡(jiǎn)單,成功率高,培養(yǎng)48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)絨毛組織表達(dá)的IDO具有功能活性,并且IFN-γ刺激組IDO活性顯著高于單純加DMEM/F12培養(yǎng)組(P＜0.05)。(3)HTR-8/SVneo細(xì)胞有蛋白質(zhì)及IDO mRNA表達(dá);細(xì)胞培養(yǎng)上清中可檢測(cè)到犬尿氨酸;IFN-γ可以上調(diào)IDO蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá),呈藥物濃度的依賴性(P＜0.05)。(4)RSA組絨毛和蛻膜組織中IDO蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)水平均顯著低于正常妊娠組(P＜0.05)。 結(jié)論:絨毛及蛻膜組織IDO正常表達(dá)是維持妊娠所必需;HTR-8/SVneo細(xì)胞表達(dá)有活性的IDO。 第二部分HTR-8/SVneo細(xì)胞IDO表達(dá)對(duì)dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞表面NKG2D和NKp46表達(dá)及殺傷活性功能的影響 目的:探討HTR-8/SVneo細(xì)胞IDO表達(dá)對(duì)dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞表面活化性受體NKp46和NKG2D表達(dá)及殺傷活性等功能的影響。 方法:(1)體外分離正常孕5-9周蛻膜組織單個(gè)核細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞,免疫磁珠分選法純化CD56~+dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞。(2)FCM法檢測(cè)分離純化的CD56~+dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞的純度和表型。(3)將分離純化的CD56~+dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞體外培養(yǎng)48小時(shí),根據(jù)條件培養(yǎng)基(CM)類型將試驗(yàn)分為3組:正常培養(yǎng)基組(陰性培養(yǎng)基對(duì)照組);HTR-8/SVneo細(xì)胞48h獲得的條件培養(yǎng)基組(IDO CM組);HTR-8/SVneo細(xì)胞+色氨酸阻斷劑1-MT 48 h獲得的條件培養(yǎng)基組(IDO+1-MT CM組)。培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞,采用定量RT-PCR法分別檢測(cè)CD56~+dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞表面受體NKp46 mRNA及NKG2D mRNA表達(dá)水平,FCM法分析NKp46及NKG2D蛋白質(zhì)表達(dá)水平。(4)進(jìn)一步采用LDH法檢測(cè)CD56~+dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。(5)ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的TNF-α水平。 結(jié)果:(1)機(jī)械法體外分離正常5-9孕周蛻膜組織單個(gè)核細(xì)胞,Ficoll-Hypaque法分離蛻膜單個(gè)核細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞,免疫磁珠分選法進(jìn)一步純化CD56~+dNK細(xì)胞和pNK細(xì)胞。(2)FCM法分析免疫磁珠分選法純化的CD56~+CD3~-NK細(xì)胞純度,結(jié)果顯示:占dNK細(xì)胞的90%以上,其中CD56~(bright)CD16~(dim)占97%以上;占pNK細(xì)胞的55%以上,其中CD56~(dim)CD16~-NK細(xì)胞占40%左右,CD56~(dim)CD16~+NK細(xì)胞占60%左右。(3)dNK細(xì)胞分組試驗(yàn)結(jié)果顯示,陰性培養(yǎng)基對(duì)照組、IDO CM組和IDO+1-MT CM組組間比較,NKG2D和NKp46 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異;pNK細(xì)胞分組試驗(yàn)結(jié)果顯示,NKG2D和NKp46 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在IDO CM組顯著高于陰性培養(yǎng)基對(duì)照組和IDO+1-MT CM組(P＜0.05)。(4)dNK細(xì)胞殺傷活性在陰性培養(yǎng)基對(duì)照組、IDO CM組和IDO+1-MT CM組各組間比較無顯著差異(P＞0.05);pNK細(xì)胞殺傷活性在IDO CM組顯著低于陰性對(duì)培養(yǎng)基照組和IDO+1-MTCM組(P＜0.05)。(5)dNK細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF-α水平各組間比較無顯著差異(P＞0.05);pNK細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α水平在IDO CM組顯著低于陰性培養(yǎng)基對(duì)照組和IDO+1-MT CM組(P＜0.05)。 結(jié)論:HTR-8/SVneo表達(dá)的IDO能夠下調(diào)pNK細(xì)胞表面NKp46及NKG2D受體表達(dá),并降低pNK殺傷活性和分泌TNF-α的能力,而不降低dNK細(xì)胞殺傷活性等功能。 第三部分妊娠早期蛻膜組織中BDCA-1(+),BDCA-2(+)和BDCA-3(+)樹突狀細(xì)胞的分布和表型特點(diǎn) 目的:利用新近發(fā)現(xiàn)的BDCA標(biāo)志來檢測(cè)妊娠早期蛻膜組織中DC亞群及其表型特點(diǎn),并進(jìn)一步分析DC亞群數(shù)量隨孕周變化的特點(diǎn)。 方法:(1)機(jī)械法分離6-9孕周(n=44,每孕周11例)蛻膜組織中的單個(gè)核細(xì)胞,FCM法檢測(cè)蛻膜單個(gè)核細(xì)胞中BDCA-1~+ MDC1,BDCA-3~+ MDC2和BDCA-2~+ PDC亞群。(2)FCM法進(jìn)一步檢測(cè)BDCA-1~+ MDC1和BDCA-3~+ MDC2亞群的表型特點(diǎn),分析HLA-DR、CD86、CD80和ILT3的表達(dá)水平。(3)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)妊娠早期蛻膜組織(n=12)中BDCA-1~+和BDCA-3~+細(xì)胞。 結(jié)果:(1)發(fā)現(xiàn)正常妊娠早期蛻膜組織中存在3個(gè)DC亞群,分別是:BDCA-1~+CD19~-CD14~-MDC1.BDCA-3~+CD14~-MDC2和BDCA-2~+CD123~+PDC亞群。蛻膜組織中MDC1占分離的蛻膜單個(gè)核細(xì)胞的百分率與外周血相似,兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.055)。蛻膜組織中MDC2顯著高于外周血,而PDC顯著低于外周血(P＜0.001)。(2)MDC1與MDC2均表達(dá)低水平的HLA-DR,CD86和CD80,提示它們具有未成熟DCs的表型特點(diǎn);MDC1與MDC2均表達(dá)ILT3。(3)隨著孕周增加(6-9周),蛻膜單個(gè)核細(xì)胞中MDC1比例顯著降低,而MDC2的比例顯著增加(P＜0.05)。(4)免疫組化法發(fā)現(xiàn)妊娠早期蛻膜組織中存在BDCA-1~+和BDCA-3~+細(xì)胞,BDCA-3~+細(xì)胞分布于近血管和近腺體周圍。 結(jié)論:我們首次描述了妊娠早期蛻膜組織中存在BDCA-1~+CD19~-CD14~-MDC1,BDCA-3~+CD14~-MDC2和BDCA-2~+CD123~+PDC亞群。它們的分布和表型特點(diǎn)提示其可能參與母胎免疫耐受的誘導(dǎo)。本研究為進(jìn)一步了解DCs在母胎界面免疫調(diào)節(jié)中的作用提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392;R714

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1663142