本文選題：銅綠假單胞菌　切入點(diǎn)：OprM蛋白　出處：《昆明醫(yī)學(xué)院》2009年碩士論文

【摘要】： 目的構(gòu)建銅綠假單胞菌主動(dòng)外排系統(tǒng)外膜蛋白OprM的原核表達(dá)模型,并誘導(dǎo)OprM蛋白的表達(dá)。 方法采用基因工程技術(shù),通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的探討,擬確定帶有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基的銅綠假單胞菌oprM基因的PCR擴(kuò)增條件,將oprM基因和載體pET28a-c(+)進(jìn)行體外重組后導(dǎo)入受體菌BL21(DE3),通過抗性篩選、菌落PCR擴(kuò)增、酶切驗(yàn)證和DNA測(cè)序等方法篩選正確的外膜蛋白OprM的原核表達(dá)模型。再對(duì)影響OprM蛋白表達(dá)的重要因素進(jìn)行探討,擬確定最適的誘導(dǎo)條件,誘導(dǎo)表達(dá)帶有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白OprM,并用SDS-PAGE和Western Blot技術(shù)對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果 1.通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的探討,擴(kuò)增帶有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基的oprM基因序列的PCR反應(yīng)體系為:dNTP 200μmol/L,MgSO_4 1.5mmol/L,引物400nmol/L,保真酶(Pfu)0.1U/μl,模板1μl,2×增強(qiáng)劑,1×反應(yīng)緩沖液,總體系50μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,95℃45 sec、50℃1 min、72℃2 min,循環(huán)次數(shù)35,72℃延伸7min。擴(kuò)增完成后,在反應(yīng)體系中加入普通Taq DNA聚合酶0.6μl(3U),于72℃延伸20 min以修飾PCR產(chǎn)物A尾。 2.對(duì)質(zhì)粒pET28a-c-oprM中的oprM基因片段進(jìn)行正反兩個(gè)方向的序列測(cè)定,所得序列應(yīng)用Blast 2進(jìn)行分析,與GeneBank中公布的oprM基因序列基本吻合,發(fā)現(xiàn)一個(gè)堿基突變,經(jīng)驗(yàn)證為密碼子同義突變,不影響蛋白質(zhì)序列翻譯。 3.通過對(duì)OprM蛋白表達(dá)條件的探討,最適誘導(dǎo)條件為BL21-pET28a-c-oprM在含終濃度為0.05mg/ml卡那霉素(Kanamycin)的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到濃度為0.5 OD_(600)時(shí),加入1.5mmol/L終濃度的誘導(dǎo)劑IPTG,25℃振蕩培養(yǎng)過夜。 4.SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白OprM確為帶His·Tag的不可溶蛋白。 結(jié)論成功構(gòu)建了銅綠假單胞菌主動(dòng)外排系統(tǒng)外膜蛋白OprM的原核表達(dá)模型BL21-pET28a-c-oprM并誘導(dǎo)表達(dá)了帶His·Tag的OprM蛋白。
[Abstract]:Objective to construct a prokaryotic expression model of outer membrane protein (OprM) of Pseudomonas aeruginosa active efflux system and induce the expression of OprM protein. Methods by using genetic engineering technique, the conditions of PCR amplification of oprM gene of Pseudomonas aeruginosa with EcoR 鈪，

本文編號(hào)：1661009