本文選題：日本血吸蟲　切入點(diǎn)：IFN-誘導(dǎo)的p47　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 目前,血吸蟲病防治面臨的棘手問題之一在于再感染難以控制,人們一直期待采用人用疫苗作為化療重要的補(bǔ)充手段進(jìn)行疾病控制,因此,血吸蟲感染宿主的免疫應(yīng)答規(guī)律作為疫苗研制的免疫學(xué)基礎(chǔ)受到更多關(guān)注。然而長期以來,疫苗研制的理論基礎(chǔ)一直成為眾多學(xué)者有爭議的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)意義上的以激發(fā)Th2型免疫應(yīng)答(以IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子分泌為主,主要介導(dǎo)體液免疫)的血吸蟲病疫苗,主要采用特異性抗體篩選優(yōu)勢抗原,所誘導(dǎo)的保護(hù)力往往并不理想。目前更多的證據(jù)支持Th1型免疫應(yīng)答(以IFN-γ分泌為主,主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫)作為抗血吸蟲感染的保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制。 曼氏血吸蟲感染小鼠模型中細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果顯示,在童蟲移行并發(fā)育成熟過程中,淋巴細(xì)胞主要產(chǎn)生針對童蟲或成蟲抗原的IFN-γ;隨著組織中蟲卵的沉積(感染后5w),細(xì)胞因子表達(dá)譜逐漸發(fā)生了改變,到感染后8w,主要以高水平的IL-4、IL-5為主,IFN-γ水平較低,提示在感染早期,IFN-γ可能發(fā)揮重要的作用;在蟲卵沉積后,宿主的免疫應(yīng)答出現(xiàn)由Th1型向Th2型的漂移。本實(shí)驗(yàn)室前期采用基因芯片結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)研究日本血吸蟲感染小鼠過程中觀察到:如同曼氏血吸蟲感染,IFN-γ的基因轉(zhuǎn)錄水平從感染急性期至慢性期逐步受到抑制;但是值得關(guān)注的是,干擾素刺激基因(ISGs)(如:IGTP,GBP,ICSBP等),受抑制程度尤為顯著,表現(xiàn)為下調(diào)發(fā)生較IFN-γ早(成蟲排卵前),且下調(diào)速度更快。ISGs是IFN-γ下游通路中的作用因子,其表達(dá)下調(diào)則反映出隨著日本血吸蟲感染進(jìn)程,宿主體內(nèi)存在著干擾素通路的抑制,阻礙干擾素生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮。 IFN-誘導(dǎo)的p47 GTP酶家族是近十年來在多種脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一類重要的具有抗感染作用的蛋白家族。目前已經(jīng)克隆了小鼠p47GTP酶家族中的六個(gè)成員,分別是LRG-47、GTPI、IGTP、IRG-47、IIGP和TGTP/Mg21。研究發(fā)現(xiàn),p47 GTP酶能夠特異地參與抵抗胞內(nèi)細(xì)菌和原蟲的感染,對病毒的清除能力較弱。雖然同屬于p47 GTP酶家族,但不同成員所表達(dá)的抗力具有病原體和時(shí)相特異性的特點(diǎn)。然而,p47 GTP酶在更為復(fù)雜的多細(xì)胞生物,例如重要的胞外蠕蟲—血吸蟲感染中的作用目前還未見報(bào)道。鑒于本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),p47GTP酶隨日本血吸蟲感染進(jìn)程,信號強(qiáng)度呈下調(diào)趨勢,且家族中各成員的表達(dá)強(qiáng)度存在明顯差異,提示不同p47 GTP酶在多細(xì)胞生物感染中的作用可能不盡相同。在本研究中,我們探討了IFN-誘導(dǎo)的p47 GTP酶家族中的IGTP和IRG-47在日本血吸蟲急性感染中的作用特點(diǎn)及參與保護(hù)性免疫的能力,以進(jìn)一步深化血吸蟲的感染免疫學(xué),為血吸蟲病疫苗研制提供理論基礎(chǔ)。 本研究采用IGTP基因敲除(IGTP~(-/-))和IRG-47基因敲除(IRG-47~(-/-))小鼠,以相同遺傳背景的野生型C57BL/6J小鼠(wild-type,WT)為對照,建立日本血吸蟲急性感染的小鼠模型。為了觀察感染/致病結(jié)果,在感染后6w通過肝門靜脈沖蟲計(jì)數(shù)成蟲數(shù)、消化肝臟計(jì)數(shù)蟲卵數(shù),以HE染色和Masson三色染色觀察肝臟的病理變化;為了觀察感染后宿主的整體免疫應(yīng)答反應(yīng),以間接ELISA法檢測血清中日本血吸蟲特異性IgG抗體,以Bio-plex技術(shù)檢測感染急性期血清和脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1/Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)水平;鑒于p47 GTP酶主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞在天然免疫中的重要作用,我們觀察了基因敲除后對巨噬細(xì)胞功能的影響。通過貼壁法分離純化脾臟巨噬細(xì)胞后,采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測巨噬細(xì)胞中p47 GTP酶家族三個(gè)成員(igtp、lrg47、irg47)的mRNA水平,以考察一種基因缺失后是否存在p47 GTP酶家族其他成員的交叉調(diào)控;以流式細(xì)胞術(shù)檢測不同時(shí)期(感染前、蟲卵沉積前期、感染急性期)巨噬細(xì)胞上表面分子MHC-Ⅱ類、CD16/32、CD40、CD80的表達(dá)水平,觀察巨噬細(xì)胞的抗原遞呈功能;在脂多糖(LPS)刺激下,采用硝酸還原酶法觀察巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中一氧化氮(NO)的濃度;通過體外殺傷童蟲的試驗(yàn),觀察在血清抗體的協(xié)同下巨噬細(xì)胞的殺傷活性。 本研究獲得如下主要結(jié)果: 1、在日本血吸蟲急性感染過程中,IGTP~(-/-)小鼠與WT小鼠相比表現(xiàn)出相似的感染結(jié)局,而IRG-47~(-/-)小鼠能部分限制急性感染。IGTP~(-/-)組的成蟲數(shù)和蟲卵數(shù)略高于WT組,而與這兩組相比,感染后IRG-47~(-/-)組小鼠的成蟲數(shù)和蟲卵數(shù)明顯減少。在HE染色的病理切片中,IGTP~(-/-)組和WT組可見大量蟲卵聚集在匯管區(qū),而IRG-47~(-/-)組集中在匯管區(qū)的蟲卵則較少。在IRG-47~(-/-)組,含有單個(gè)蟲卵的肉芽腫中可見大量的嗜酸性粒細(xì)胞聚集,包繞蟲卵的細(xì)胞總數(shù)也較IGTP~(-/-)組和WT組顯著增多。Masson染色顯示,WT組蟲卵肉芽腫周圍的總膠原含量顯著高于IGTP~(-/-)組和IRG-47~(-/-)組。 2、在日本血吸蟲感染急性期,IRG-47~(-/-)小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平低于IGTP~(-/-)小鼠和WT小鼠,IGTP~(-/-)小鼠較WT小鼠有所增強(qiáng)。血清中細(xì)胞因子檢測顯示,IGTP~(-/-)小鼠和WT小鼠在感染急性期能夠產(chǎn)生大量的Th1/Th2型細(xì)胞因子,且IGTP~(-/-)小鼠較WT小鼠產(chǎn)生較多的GM-CSF和IL-2。但是,IRG-47~(-/-)小鼠產(chǎn)生的細(xì)胞因子,無論是Th1型還是Th2型,都顯著低于IGTP~(-/-)小鼠和WT小鼠。脾淋巴細(xì)胞以可溶性蟲卵抗原(SEA)或ConA刺激后檢測上清中的細(xì)胞因子顯示,在特異性抗原和有絲分裂原刺激下,IGTP~(-/-)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12p70、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-5和IL-10的水平均較WT小鼠顯著增高。IRG-47~(-/-)組與WT組相比,在ConA刺激下,IRG-47~(-/-)組脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-12p70和IL-10水平高于WT組,余細(xì)胞因子在兩組間無顯著性差異。 3、就產(chǎn)生成蟲特異性IgG抗體的能力而言,IGTP~(-/-)小鼠略強(qiáng)于IRG-47~(-/-)小鼠和WT小鼠。隨著日本血吸蟲感染的發(fā)展,三組小鼠血清中日本血吸蟲特異性IgG抗體水平均持續(xù)升高。在日本血吸蟲急性感染期,針對可溶性成蟲抗原(SWAP)特異的IgG抗體水平,在IGTP~(-/-)組小鼠顯著高于IRG-47~(-/-)組和WT組;針對可溶性蟲卵抗原(SEA)特異的IgG抗體水平,在三組小鼠間均無顯著性差異。 4、irg47基因缺失后可能存在igtp和lrg47基因的交叉調(diào)控。從感染后3w到6w,在WT小鼠的巨噬細(xì)胞中,igtp和lrg47基因的表達(dá)有下降趨勢,而irg47基因變化較小。在IGTP~(-/-)小鼠的巨噬細(xì)胞中,lrg47和irg47基因表達(dá)下調(diào)。相反,在IRG-47~(-/-)小鼠的巨噬細(xì)胞中,igtp基因的表達(dá)變化較少,而lrg47基因的表達(dá)明顯上調(diào)。這提示IRG-47缺失后可能存在igtp和lrg47基因的交叉調(diào)控,而IGTP缺失則不存在。 5、igtp或irg47基因缺失不影響巨噬細(xì)胞發(fā)育成熟。隨著日本血吸蟲感染的發(fā)展,巨噬細(xì)胞表面分子MHC-Ⅱ類(I-A)、CDl6/32、CD40和CD80,無論是在基因敲除小鼠還是野生型小鼠的表達(dá)均明顯上升。在感染前和感染后3w,IGTP~(-/-)組CD16/32和CD40的表達(dá)均較IRG-47~(-/-)組和WT組高;在感染后6w,三組間各分子標(biāo)記的表達(dá)均無顯著性差異。巨噬細(xì)胞表面分子的表達(dá)類型提示,在日本血吸蟲感染早期,igtp基因缺失時(shí),可能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞CD16/32(FcγⅢ/Ⅱ)介導(dǎo)的抗原遞呈處理能力。 6、在日本血吸蟲感染急性期,巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子NO的潛能不受IGTP和IRG-47缺失的影響。在日本血吸蟲感染前,不論有無LPS刺激,各組巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO均無顯著差異。在感染后6w,無任何刺激的情況下,IGTP~(-/-)組的巨噬細(xì)胞較IRG-47~(-/-)組和WT組的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的NO;而以LPS刺激后三組巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO水平無顯著性差異。 7、感染活化的巨噬細(xì)胞與血清體外協(xié)同殺傷童蟲試驗(yàn)顯示,IGTP~(-/-)組的童蟲死亡率顯著高于WT組。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明,感染活化的巨噬細(xì)胞協(xié)同日本血吸蟲感染血清或青蒿琥酯化療血清具有殺傷童蟲活性。以日本血吸蟲感染IGTP~(-/-)、IRG-47~(-/-)和WT小鼠6w的巨噬細(xì)胞和相應(yīng)的血清體外協(xié)同殺傷童蟲試驗(yàn)顯示,IGTP~(-/-)組的童蟲死亡率為37.5%,明顯較WT組(29.41%)高。IGTP~(-/-)組的高童蟲死亡率可能與其血清中針對日本血吸蟲成蟲特異性IgG抗體水平較高有關(guān)。 綜上,在日本血吸蟲急性感染期,IGTP~(-/-)小鼠和IRG-47~(-/-)小鼠在感染/致病結(jié)局、整體免疫應(yīng)答,以及巨噬細(xì)胞功能等方面均存在明顯的差異,提示不同p47 GTP酶(IGTP,IRG-47)在宿主建立對日本血吸蟲感染抗力過程中可能發(fā)揮著不同的作用。但為何不同p47 GTP酶的敲除會(huì)造成宿主在日本血吸蟲感染后出現(xiàn)不同的感染結(jié)局,繼之引起免疫應(yīng)答的差異,還有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：1659075