發(fā)布時間：2018-03-23 23:05

  本文選題：肌纖生成調節(jié)因子-1　切入點：心肌肥大　出處：《中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院》2010年博士論文

【摘要】： 研究背景： 人肌纖生成調節(jié)因子-1(human myofibrillogenesis regulator 1, hMR-1)是本課題組克隆的一個人類新功能基因,它定位于人類染色體2q35,全長755bp,編碼一段142個氨基酸組成的蛋白質。前期工作證實,MR-1高表達于心肌和骨骼肌,免疫組化證實人類心肌肌原纖維上有MR-1分布,血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)誘導肥大心肌細胞中MR-1表達顯著升高,以RNA干擾(RNA interference, RNAi)下調MR-1表達后則降低AngⅡ誘導的心肌肥大效果,提示MR-1與心肌肥大有關。既往工作通過酵母雙雜交和GST pull-down實驗發(fā)現(xiàn),MR-1與肌球蛋白調節(jié)型輕鏈(myosin light chain-2, MRLC)、myomesin-1和β-烯醇酶(β-enolase)等與肌肉收縮裝置相關的蛋白間存在相互作用,提示MR-1可能通過調節(jié)心肌肌原纖維引起心肌肥大。不過,MR-1是否可以直接引起心肌肥大以及MR-1致心肌肥大的分子機制尚不清楚。研究目的： 制備有效的抗MR-1抗體,構建MR-1真核表達質粒,建立MR-1沉默方法,在體外培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞模型上驗證MR-1過表達直接引起肥大以及MR-1對心肌細胞肌原纖維生成與肌原纖維排列產生影響,闡明MR-1調節(jié)心肌肌原纖維改變的分子機制,旨在證實“MR-1通過促進肌原纖維生成引起心肌細胞肥大”。 研究方法： 1.抗體制備：生物信息學分析人類MR-1 (hMR-1)優(yōu)勢抗原肽,合成并混合后免疫家兔,抗血清以親和層析法純化后檢測抗體的特異性及適用范圍；質粒構建：根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫的hMR-1 mRNA信息克隆全長序列至pcDNA3.1-HisB(-)-Myc載體的多克隆位點；RNA干擾實驗：根據(jù)大鼠源MR-1 (rMR-1)基因序列設計靶點并合成穩(wěn)定修飾型stealth siRNA,篩選高沉默效率的MR-1-stealth siRNA. 2.乳大鼠心肌細胞培養(yǎng)與心肌細胞肥大模型的建立：培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞以終濃度1×10-7mol／L的血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)孵育48h,以復制AngⅡ致心肌細胞肥大模型；專業(yè)圖像軟件分析細胞平均表面積、[3H]-亮氨酸摻入法檢測細胞蛋白合成速率,以及RT-PCR法檢測心房利鈉因子(atrial natriuretic factor, ANF)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)的轉錄水平,以證實心肌肥大的形成。 3.肌原纖維生成(myofibrillogenesis)與排列觀察：以FITC-鬼筆環(huán)肽特異性標記F-actin,觀察橫紋樣F-actin的形成。 4.細胞內信號分子檢測：以細胞免疫熒光技術檢測分子的亞定位、共定位及轉位現(xiàn)象,以RT-PCR和Western Blot方法檢測分子在mRNA和蛋白水平的表達。 5.[Ca2+]i和鈣調神經磷酸酶(calcineurin, CaN)活性檢測：Fluo-3AM熒光探針標記胞漿Ca2+并半定量分析平均熒光強度,比色法檢測CaN比活力。 6.圖像分析、數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析：細胞平均表面積、條帶積分光密度、[Ca2+]i平均熒光強度以專業(yè)圖像軟件Image Pro-Plus (version 4.11)進行半定量分析；各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示,以統(tǒng)計學軟件SPSS13.0分析,多組間兩兩比較用Bonferroni's test,P0.05認為具有顯著性差異。 實驗結果 1.制備了兔抗hMR-1多克隆抗體,可識別人源性及鼠源性MR-1抗原,適用于Western Blot和細胞免疫熒光實驗。構建了MR-1真核表達質粒并在乳大鼠心肌細胞成功過表達外源hMR-1蛋白。根據(jù)沉默效率篩選stealth siRNA并轉染乳大鼠心肌細胞,有效沉默了內源rMR-1表達。 2.MR-1過表達引起心肌細胞肥大：細胞表面積、[3H]-亮氨酸摻入和ANF和BNP轉錄明顯增加(P0.05)；MR-1-RNAi對ANF和BNP的轉錄水平有所降低而對細胞表面積和蛋白合成速率無顯著影響；此外,RNAi對AngⅡ誘導的三項肥大指標增加均明顯逆轉。 3.MR-1過表達對心肌肌原纖維的影響：正常對照組心肌細胞F-actin呈“非橫紋樣(nonstriated-like)”和“非肌肉類型(nonmuscule-like pattern) ",主要沿胞膜內側面分布；過表達MR-1組F-actin呈節(jié)段狀,為典型的“橫紋樣”類型,且有25.0±6.7%的細胞肌原纖維呈紊亂排列,提示MR-1過表達促進肌原纖維生成(myofibrillogenesis)及其排列紊亂；MR-1-RNAi組F-actin呈“應力纖維樣(stress fiber-like) ",與隨機RNA對照組類似,并且MR-1-RNAi明顯逆轉了AngⅡ誘導的橫紋樣F-actin形成。 4.對MR-1調節(jié)肌原纖維改變的分子機制研究： 1)MR-1與MRLC共定位明顯,均分布于胞漿并濃集于核周。在正常培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞中,MR-1與myomesin-1無共定位,但MR-1過表達引起myomesin-1轉位至胞漿后,myomesin-1與胞漿的MR-1發(fā)生部分共定位。 2)MR-1過表達明顯上調myomesin-1和MRLC mRNA及蛋白的表達(P0.05),MR-1-RNAi對myomesin-1和MRLC表達無顯著影響,但逆轉了AngⅡ引起的myomesin-1和上調。 3)MR-1過表達促進myomesin-1的核-漿轉位,MR-1-RNAi對轉位無顯著影響,但可在一定程度上抑制AngⅡ引起的myomesin-1轉位。 4)過表達SUMO-1引起myomesin-1核-漿轉位,促進肌原纖維生成；抑制MR-1明顯逆轉SUMO-1過表達引起的myomesin-1轉位及肌原纖維生成,提示MR-1可能在myomesin-1的SUMO化修飾及SUMO化介導的肌纖生成過程中發(fā)揮關鍵作用。 5)MR-1過表達引起[Ca2+]i、CaN活性、肌細胞增強因子-2C(myocytes enhancer factor 2C, MEF-2C)和磷酸化-MEF-2C水平顯著升高(P0.05),MR-1-RNAi對這些無顯著影響(P0.05),但可逆轉AngⅡ引起的升高。 研究結論： 1 MR-1過表達直接誘導乳大鼠心肌細胞肥大。 2 MR-1通過促進肌原纖維生成及排列紊亂致乳大鼠心肌細胞肥大。 3 MR-1通過調節(jié)myomesin-1與MRLC影響肌原纖維生成,從而引起心肌細胞肥大。(主要結論) 4 MR-1可能在“Ca2+→CaN→MEF-2C”這一致心肌肥大的經典信號途徑中發(fā)揮重要作用。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關期刊論文 前7條

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本文編號：1655591