本文選題：肌纖生成調(diào)節(jié)因子-1　切入點(diǎn)：心肌肥大　出處：《中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院》2010年博士論文

【摘要】： 研究背景： 人肌纖生成調(diào)節(jié)因子-1(human myofibrillogenesis regulator 1, hMR-1)是本課題組克隆的一個(gè)人類新功能基因,它定位于人類染色體2q35,全長755bp,編碼一段142個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。前期工作證實(shí),MR-1高表達(dá)于心肌和骨骼肌,免疫組化證實(shí)人類心肌肌原纖維上有MR-1分布,血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞中MR-1表達(dá)顯著升高,以RNA干擾(RNA interference, RNAi)下調(diào)MR-1表達(dá)后則降低AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大效果,提示MR-1與心肌肥大有關(guān)。既往工作通過酵母雙雜交和GST pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MR-1與肌球蛋白調(diào)節(jié)型輕鏈(myosin light chain-2, MRLC)、myomesin-1和β-烯醇酶(β-enolase)等與肌肉收縮裝置相關(guān)的蛋白間存在相互作用,提示MR-1可能通過調(diào)節(jié)心肌肌原纖維引起心肌肥大。不過,MR-1是否可以直接引起心肌肥大以及MR-1致心肌肥大的分子機(jī)制尚不清楚。研究目的： 制備有效的抗MR-1抗體,構(gòu)建MR-1真核表達(dá)質(zhì)粒,建立MR-1沉默方法,在體外培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞模型上驗(yàn)證MR-1過表達(dá)直接引起肥大以及MR-1對(duì)心肌細(xì)胞肌原纖維生成與肌原纖維排列產(chǎn)生影響,闡明MR-1調(diào)節(jié)心肌肌原纖維改變的分子機(jī)制,旨在證實(shí)“MR-1通過促進(jìn)肌原纖維生成引起心肌細(xì)胞肥大”。 研究方法： 1.抗體制備：生物信息學(xué)分析人類MR-1 (hMR-1)優(yōu)勢抗原肽,合成并混合后免疫家兔,抗血清以親和層析法純化后檢測抗體的特異性及適用范圍；質(zhì)粒構(gòu)建：根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫的hMR-1 mRNA信息克隆全長序列至pcDNA3.1-HisB(-)-Myc載體的多克隆位點(diǎn)；RNA干擾實(shí)驗(yàn)：根據(jù)大鼠源MR-1 (rMR-1)基因序列設(shè)計(jì)靶點(diǎn)并合成穩(wěn)定修飾型stealth siRNA,篩選高沉默效率的MR-1-stealth siRNA. 2.乳大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)與心肌細(xì)胞肥大模型的建立：培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞以終濃度1×10-7mol／L的血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)孵育48h,以復(fù)制AngⅡ致心肌細(xì)胞肥大模型；專業(yè)圖像軟件分析細(xì)胞平均表面積、[3H]-亮氨酸摻入法檢測細(xì)胞蛋白合成速率,以及RT-PCR法檢測心房利鈉因子(atrial natriuretic factor, ANF)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)的轉(zhuǎn)錄水平,以證實(shí)心肌肥大的形成。 3.肌原纖維生成(myofibrillogenesis)與排列觀察：以FITC-鬼筆環(huán)肽特異性標(biāo)記F-actin,觀察橫紋樣F-actin的形成。 4.細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子檢測：以細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測分子的亞定位、共定位及轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,以RT-PCR和Western Blot方法檢測分子在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。 5.[Ca2+]i和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin, CaN)活性檢測：Fluo-3AM熒光探針標(biāo)記胞漿Ca2+并半定量分析平均熒光強(qiáng)度,比色法檢測CaN比活力。 6.圖像分析、數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：細(xì)胞平均表面積、條帶積分光密度、[Ca2+]i平均熒光強(qiáng)度以專業(yè)圖像軟件Image Pro-Plus (version 4.11)進(jìn)行半定量分析；各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,以統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0分析,多組間兩兩比較用Bonferroni's test,P0.05認(rèn)為具有顯著性差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.制備了兔抗hMR-1多克隆抗體,可識(shí)別人源性及鼠源性MR-1抗原,適用于Western Blot和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建了MR-1真核表達(dá)質(zhì)粒并在乳大鼠心肌細(xì)胞成功過表達(dá)外源hMR-1蛋白。根據(jù)沉默效率篩選stealth siRNA并轉(zhuǎn)染乳大鼠心肌細(xì)胞,有效沉默了內(nèi)源rMR-1表達(dá)。 2.MR-1過表達(dá)引起心肌細(xì)胞肥大：細(xì)胞表面積、[3H]-亮氨酸摻入和ANF和BNP轉(zhuǎn)錄明顯增加(P0.05)；MR-1-RNAi對(duì)ANF和BNP的轉(zhuǎn)錄水平有所降低而對(duì)細(xì)胞表面積和蛋白合成速率無顯著影響；此外,RNAi對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的三項(xiàng)肥大指標(biāo)增加均明顯逆轉(zhuǎn)。 3.MR-1過表達(dá)對(duì)心肌肌原纖維的影響：正常對(duì)照組心肌細(xì)胞F-actin呈“非橫紋樣(nonstriated-like)”和“非肌肉類型(nonmuscule-like pattern) ",主要沿胞膜內(nèi)側(cè)面分布；過表達(dá)MR-1組F-actin呈節(jié)段狀,為典型的“橫紋樣”類型,且有25.0±6.7%的細(xì)胞肌原纖維呈紊亂排列,提示MR-1過表達(dá)促進(jìn)肌原纖維生成(myofibrillogenesis)及其排列紊亂；MR-1-RNAi組F-actin呈“應(yīng)力纖維樣(stress fiber-like) ",與隨機(jī)RNA對(duì)照組類似,并且MR-1-RNAi明顯逆轉(zhuǎn)了AngⅡ誘導(dǎo)的橫紋樣F-actin形成。 4.對(duì)MR-1調(diào)節(jié)肌原纖維改變的分子機(jī)制研究： 1)MR-1與MRLC共定位明顯,均分布于胞漿并濃集于核周。在正常培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞中,MR-1與myomesin-1無共定位,但MR-1過表達(dá)引起myomesin-1轉(zhuǎn)位至胞漿后,myomesin-1與胞漿的MR-1發(fā)生部分共定位。 2)MR-1過表達(dá)明顯上調(diào)myomesin-1和MRLC mRNA及蛋白的表達(dá)(P0.05),MR-1-RNAi對(duì)myomesin-1和MRLC表達(dá)無顯著影響,但逆轉(zhuǎn)了AngⅡ引起的myomesin-1和上調(diào)。 3)MR-1過表達(dá)促進(jìn)myomesin-1的核-漿轉(zhuǎn)位,MR-1-RNAi對(duì)轉(zhuǎn)位無顯著影響,但可在一定程度上抑制AngⅡ引起的myomesin-1轉(zhuǎn)位。 4)過表達(dá)SUMO-1引起myomesin-1核-漿轉(zhuǎn)位,促進(jìn)肌原纖維生成；抑制MR-1明顯逆轉(zhuǎn)SUMO-1過表達(dá)引起的myomesin-1轉(zhuǎn)位及肌原纖維生成,提示MR-1可能在myomesin-1的SUMO化修飾及SUMO化介導(dǎo)的肌纖生成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 5)MR-1過表達(dá)引起[Ca2+]i、CaN活性、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2C(myocytes enhancer factor 2C, MEF-2C)和磷酸化-MEF-2C水平顯著升高(P0.05),MR-1-RNAi對(duì)這些無顯著影響(P0.05),但可逆轉(zhuǎn)AngⅡ引起的升高。 研究結(jié)論： 1 MR-1過表達(dá)直接誘導(dǎo)乳大鼠心肌細(xì)胞肥大。 2 MR-1通過促進(jìn)肌原纖維生成及排列紊亂致乳大鼠心肌細(xì)胞肥大。 3 MR-1通過調(diào)節(jié)myomesin-1與MRLC影響肌原纖維生成,從而引起心肌細(xì)胞肥大。(主要結(jié)論) 4 MR-1可能在“Ca2+→CaN→MEF-2C”這一致心肌肥大的經(jīng)典信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1655591