本文選題：植物疫苗　切入點：E.coli　出處：《山東大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： E.coli O157:H7在臨床感染中常常引起血樣腹瀉,貧血和腎臟的衰竭,嚴(yán)重者常常危及患者生命。由于采用抗生素療法能夠?qū)е翬.coli O157:H7的細(xì)胞壁溶解促進細(xì)胞毒素的釋放而加重病程,在臨床中針對E.coli O157:H7的感染以預(yù)防和保守療法為主。為了有效預(yù)防E.coli O157:H7在臨床中的感染,本文針對大腸桿菌O157:H7主要免疫原EspA進行了口服植物疫苗研究。 由于E.coli O157:H7的主要侵入途徑是消化道,因此在疫苗的研究中如何能夠激起機體有效的粘膜免疫是研究的重點。注射免疫途徑的疫苗往往不能有效誘導(dǎo)腸道內(nèi)的特異免疫反應(yīng)。如果口服疫苗抗原沒有經(jīng)過特殊的處理而直接進行口服免疫時,能夠有效到達腸道并激起腸道內(nèi)淋巴系統(tǒng)特異反應(yīng)的抗原量太低,也不能有效誘導(dǎo)腸道內(nèi)的免疫反應(yīng)。近十年來的研究表明,植物疫苗能夠很好的解決這些免疫過程中遇到的困難。在植物表達重組抗原的過程中,由于植物的細(xì)胞壁能夠?qū)υ谥参锛?xì)胞內(nèi)表達的重組目的蛋白進行“膠囊”樣包裹,因此在植物細(xì)胞壁的保護下,表達的抗原能夠順利進入腸道,并在消化系統(tǒng)對植物細(xì)胞進行腸道內(nèi)消化時,釋放出目的抗原,從而激發(fā)有效的粘膜免疫。生菜作為種植廣泛,生長期短,成本低廉的常見蔬菜,具有可以生食的特點,因此在采用轉(zhuǎn)基因生菜免疫時,避免了采用煙草、土豆、水稻等植物表達的重組蛋白在口服免疫時需要對植物疫苗進行預(yù)處理的缺點,生菜轉(zhuǎn)基因疫苗能夠?qū)⒃谥参锛?xì)胞內(nèi)表達的蛋白順利地運送到腸道,刺激腸道淋巴系統(tǒng)的反應(yīng),因此生菜口服植物疫苗的研制在臨床使用中具有可行性好,免疫成本低,免疫途徑簡單,免疫效果可靠的特點,便于疫苗的推廣。 本研究通過對生菜中表達的來源于E.coli O157:H7的EspA生物學(xué)特性的研究,證實了大腸桿菌的EspA可以作為植物疫苗研究中的免疫原。本研究首次在植物細(xì)胞內(nèi)進行了E.coli O157:H7表面蛋白EspA的瞬時表達及穩(wěn)定表達研究,并分別對以兩種體系中表達的重組蛋白進行了動物實驗。實驗通過試驗小鼠的多克隆EspA抗體的體內(nèi)及體外保護性試驗,證實了免疫試驗小鼠產(chǎn)生的多克隆EspA抗體的對HeLa細(xì)胞的保護性作用,并通過E.coli O157:H7"縮tx-B突變株的小鼠攻毒后的腸道病理研究發(fā)現(xiàn)EspA免疫后的小鼠具有對E.coli O157:H7"縮tx-B的抵抗力。 第一部分: 致病性大腸桿菌基因組中移動的基因元件決定了致病性的細(xì)菌的毒力,他們在病原菌侵入動物或植物后發(fā)揮毒性的過程中起著關(guān)鍵的作用。其中毒力島PAI基因簇上20多個基因編碼蛋白的功能集合體—Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS),在細(xì)菌的致病過程中發(fā)揮重要的作用。在T3SS系統(tǒng)中,很多與毒力相關(guān)的亞單位的裝配機制與細(xì)菌鞭毛的裝配機制類似,其致病蛋白的裝配過程均發(fā)生在細(xì)胞的外殼上。大腸桿菌黏附過程中分泌的蛋白如EspA,EspB,EspD和EspF等蛋白都是T3SS的功能蛋白。EspB及EspD蛋白位于EspA微絲的末端,這些蛋白與宿主的細(xì)胞膜相互作用,在宿主的細(xì)胞膜上形成小孔后,效應(yīng)因子如Tir,EspB,EspG,EspF和Map通過形成的孔道進入宿主的細(xì)胞。本試驗首次在生菜中采用瞬時表達體系表達了E.coli O157:H7的EspA蛋白。 將構(gòu)建好的pBI121-espA,pBI121-ΩespA載體通過液氮凍融法分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL1,EHA105,LBA4404,GV3101和C58C1后,將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌在卡那抗性和利福平抗性的YEB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng),采用真空法轉(zhuǎn)染培養(yǎng)14天的無菌生菜小苗,轉(zhuǎn)染生菜在22℃培養(yǎng)3天后,檢測各菌株轉(zhuǎn)染生菜后EspA的表達水平,試驗發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌AGL1轉(zhuǎn)染的生菜中EspA的表達量最高,農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)染的生菜的EspA的量最低,通過檢測pBI121-espA和pBI121-ΩespA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后通過真空法轉(zhuǎn)染生菜,發(fā)現(xiàn)pBI121-ΩespA組具有比較高的EspA表達量,通過對瞬時體系中重組蛋白的表達研究,確定了不同農(nóng)桿菌菌株在生菜瞬時表達系統(tǒng)中的不同的轉(zhuǎn)染能力,這是首次在生菜瞬時表達的系統(tǒng)中進行此類綜合研究。通過免疫小鼠的實驗證實生菜細(xì)胞內(nèi)瞬時表達的EspA能夠刺激小鼠產(chǎn)生高水平的IgG和IgA抗體,這是首次關(guān)于植物表達E.coli O157:H7的主要免疫原EspA的疫苗報道。 第二部分: 在對致病性大腸桿菌的研究中,通常根據(jù)大腸桿菌對HeLa的黏附特性,來區(qū)分大腸桿菌EPEC和EHEC。Fluorescence actin assay試驗(FAS)是鑒定E.coliO157的主要方法,同時HeLa細(xì)胞也成為E.coli O157進行細(xì)胞毒性試驗的常用模式細(xì)胞。 在本部分中,乳酸菌免疫小鼠產(chǎn)生的多克隆抗體及生菜瞬時表達系統(tǒng)表達的重組蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的抗體分別用來進行HeLa細(xì)胞的黏附試驗、體外抗體與E.coli O157:H7"縮tx-B結(jié)合試驗和抗體抑制菌落的生長試驗。通過這3個實驗證實EspA特異的抗體能夠阻斷E.coli O157:H7"縮tx-B向細(xì)胞內(nèi)毒性蛋白的轉(zhuǎn)移,并能夠抑制E.coli O157:H7"縮tx-B感染細(xì)胞產(chǎn)生的特異性的細(xì)胞骨架改變,但在體外的實驗中,抗體與細(xì)胞相互作用后,再用E.coli O157:H7"縮tx-B感染細(xì)胞,并不能阻止細(xì)菌與細(xì)胞的黏附。試驗的多克隆抗體能夠結(jié)合E.coliO157:H7"縮tx-B表面的EspA微絲,采用特異性的熒光標(biāo)記的羊抗鼠二抗能夠在熒光鏡下觀測到特異性的熒光。在以前的報道中,原核表達的EspA免疫小鼠產(chǎn)生的多克隆抗體能夠通過上述3個實驗得出EspA抗體具有對細(xì)胞的保護性作用。本試驗首次對乳酸菌和生菜異源表達的EspA免疫小鼠產(chǎn)生多克隆抗體進行類似的實驗,證實了乳酸菌和生菜表達的EspA具有與E.coli O157:H7的EspA微絲相同的抗原決定簇,并能夠應(yīng)用于E.coli O157:H7的口服疫苗研究。 第三部分: 細(xì)胞培養(yǎng)又嚴(yán)格地分為細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng),三者是密不可分相互聯(lián)系的。組織細(xì)胞的研究已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的各個研究領(lǐng)域。運用組織培養(yǎng)細(xì)胞具有條件可控,誤差小,能進行單因素分析的優(yōu)點。由于培養(yǎng)條件可以人為控制,所以便于進行各種物理、化學(xué)和生物的外界因素來研究細(xì)胞生命活動規(guī)律。 在本部分中,對生菜的組織培養(yǎng)進行了探討,建立了生菜的穩(wěn)定表達培養(yǎng)體系,在生菜的愈傷組織的培養(yǎng)過程中,發(fā)現(xiàn)0.2 mg-0.8 mg的6-BA均能誘導(dǎo)生菜生成愈傷組織,而在6-BA 0.8 mg/l,NAA 0.12 mg/l;6-BA 0.3 mg/l,NAA 0.12 mg/l兩種激素水平存在的條件下,愈傷組織的分化出現(xiàn)部分的褐化。在同樣培養(yǎng)條件下,0.2,0.4 mg/l 6-BA的激素水平培養(yǎng)下生菜的愈傷組織生長良好,說明0.3 mg/l6-BA的培養(yǎng)條件下,生菜細(xì)胞出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象不是由6-BA的濃度引起的,而在6-BA 0.8 mg/l,NAA 0.12 mg/l;6-BA 0.3 mg/l,NAA 0.12 mg/l中NAA的濃度均大于其余的兩組。最終通過試驗研究發(fā)現(xiàn),0.5 mg/l 6-BA和0.08 mg/l NAA的MS培養(yǎng)基是生菜顆粒狀愈傷組織和不定芽分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。25 d時觀察統(tǒng)計在含有濃度為0.3 mg/l的NAA生根培養(yǎng)基上,不僅生根率為100%,平均每株生根數(shù)為3-4條,而且生根試管苗株高為5-6 cm,生長旺盛。經(jīng)抗生素培養(yǎng)基篩選后生成的愈傷組織的百分比發(fā)現(xiàn)各農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染的水平分別為45.6%(AGL1),26.6%(C58C1),22.7%(EHA105),25%(GV3101),17.7%(LBA4404)。轉(zhuǎn)染成功率高的農(nóng)桿菌菌株依次為AGL1＞C58C1＞GV3101＞EHA105＞LBA4404。 通過同樣的方法建立了EspA在生菜愈傷組織中的穩(wěn)定表達。通過連續(xù)傳代3次后,用PCR、ELISA和Western-blot對生菜愈傷組織中的基因和蛋白分別進行檢測,在生菜愈傷組織提取的基因組中檢測到espA基因,并通過ELISA檢測后發(fā)現(xiàn)生菜愈傷組織中表達的EspA蛋白的量為1.6μg/ml,將表達EspA蛋白的生菜愈傷組織飼喂小鼠免疫后產(chǎn)生了高水平的抗體水平,用E.coli O157:H7"縮tx-B突變株進行動物攻毒試驗發(fā)現(xiàn)生菜表達的EspA愈傷組織免疫的小鼠的死亡率為50%,而對照組的死亡率為75%。通過對試驗小鼠腸道組織的病理切片檢測發(fā)現(xiàn),生菜免疫組的小鼠腸道微絨毛完整,腸道基底細(xì)胞排列緊密,而空白對照組,腸道內(nèi)容物增多,腸道微絨毛脫落,腸道基底細(xì)胞排列疏松,錯亂不齊。該實驗首次從病理組織學(xué)的研究方向論證了EspA植物疫苗對試驗動物模型的保護作用。 第四部分: EHEC O157主要產(chǎn)生兩種毒素,分別稱為志賀毒素樣Ⅰ(Stx1)和志賀毒素樣Ⅱ(Stx2)。在細(xì)菌體內(nèi),Stx2為分泌型表達,Stx1為胞內(nèi)表達。兩種毒素均由1個A亞單位和5個B亞單位組成,A亞單位具有細(xì)胞內(nèi)毒性,能與28S rRNA作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成停止,是大腸桿菌O157H7引起臨床表現(xiàn)的病理基礎(chǔ);B亞單位具有細(xì)胞結(jié)合特性,能與具有特定受體(Gb3)的細(xì)胞結(jié)合,從而引導(dǎo)A亞單位發(fā)揮作用。 針對B亞單位在EHEC疾病發(fā)展過程中的重要作用,在本部分中采用分子生物學(xué)方法對stx1B進行了基因克隆、原核表達和初步純化,同時在本試驗中將B亞單位與espA基因進行融合表達,期望兩種蛋白能夠在生菜細(xì)胞中同時表達,建立多抗原疫苗。但在隨后的動物試驗中雖然檢測到特異的EspA特異的IgA抗體,但并沒有檢測到特異的IgG抗體,分析其原因可能是B亞單位與espA基因之間沒有加入連接片段,而直接采用酶切位點直接將兩基因連接,因此限制了重組蛋白的表達,造成了重組蛋白的錯誤折疊。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392.1

【引證文獻】

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1 張彥茹;崔海辰;劉惠榮;王光霞;;金黃色葡萄球菌fnbB基因D2-D3編碼區(qū)克隆及其植物表達載體構(gòu)建[J];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2012年04期

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本文編號：1653898