本文選題：DNA依賴的蛋白激酶催化亞基　切入點：腫瘤　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2008年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 惡性腫瘤嚴重威脅著人類健康。放射治療是惡性腫瘤主要治療手段之一。然而,放療可導致腫瘤周圍正常組織受損,從而導致嚴重的副作用,同時,部分腫瘤細胞具有耐放射的生物學特性,或在放療過程中,使腫瘤細胞產(chǎn)生誘導耐受性,導致治療效果降低。目前,如何降低放療劑量、提高治療效果、減少腫瘤細胞耐受,即增強腫瘤放療的輻射敏感性已成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點之一。 放療對腫瘤細胞的殺傷效應主要是通過誘發(fā)其DNA雙鏈斷裂(DNA double- strand breaks, DSBs),從而導致腫瘤細胞程序性死亡或壞死。出現(xiàn)DSB后,細胞會對其修復,以保證基因組結(jié)構(gòu)的完整性,這也是腫瘤細胞抵抗放療的主要機制之一,DNA修復能力越強,對放射的抗性越突出。哺乳動物細胞對DSB損傷修復主要有非同源末端連接(nonhomologous end-jioning,NHEJ)和同源重組(homologous recombination,HR)兩條途徑。DNA依賴的蛋白激酶復合物(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)是NHEJ途徑中重要的組成成分。該復合物由調(diào)節(jié)亞單位Ku70/Ku80異源二聚體和催化亞基DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)組成。DNA-PKcs通過自磷酸化及磷酸化其他效應蛋白如XRCC-4、Artemis,在DSB修復中發(fā)揮重要作用。另外,DNA-PKcs還參與細胞周期G2期調(diào)控及細胞凋亡和自吞噬死亡,還可參與V(D)J重組過程、維護端粒長度。近年來,研究表明DNA-PKcs在多種類型癌組織細胞中普遍高表達,具有高轉(zhuǎn)移特性和放化療抗性的癌細胞中DNA-PKcs的表達活性顯著增高;特異性抑制DNA-PKcs導致細胞對γ射線及紫外線的敏感性增加,DNA-PKcs表達沉默細胞的生長速度和接種裸鼠后形成腫瘤的生長速度減慢,顯示DNA-PKcs具有作為放射增敏抗癌分子靶標的重要價值。 目前已有多種方式用以抑制DNA-PKcs功能,如典型的PI3K抑制劑渥漫青霉素(Wortmannin)、LY294002,特異的DNA-PKcs抑制劑OK-1035、NU7026,反義寡核苷酸,單克隆抗體以及Ku片段等。然而這些抑制劑或特異性較差、或用于機體可導致肝毒性或引起免疫反應,限制其實際應用。近年來隨著人源抗體制備技術(shù)尤其是通過噬菌體抗體庫篩選單鏈抗體技術(shù)的發(fā)展,為惡性腫瘤治療的生物制藥提供了新的技術(shù)方法。目前通過抑制DNA-PKcs用以增強腫瘤放療敏感性的實用藥物尚未上市,而針對DNA-PKcs的單鏈抗體制備未見有報道。 本研究通過噬菌體抗體庫技術(shù)篩選DNA-PKcs單鏈抗體,用以增加腫瘤細胞輻射敏感性的研究。獲得如下主要結(jié)果: 1、應用生物信息學分析軟件Biosun對DNA-PKcs蛋白進行了抗原性分析,通過BLAST比對確定了抗原性高、且與其他蛋白沒有同源性的蛋白片段DPK1、DPK2、DPK3及DPK4;RT-PCR擴增相應的基因序列,構(gòu)建原核表達載體,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3),經(jīng)優(yōu)化表達條件以包涵體形式成功表達出250個氨基酸的DPK3和257個氨基酸的DPK4蛋白片段,經(jīng)過包涵體蛋白變性、復性得到純化的DPK3、DPK4。 2、采用海軍總醫(yī)院中心實驗室建立的天然大容量噬菌體抗體庫,篩選針對DPK3、DPK4的特異性單鏈人源抗體。將一定濃度的純化可溶性蛋白DPK3、DPK4分別包被抗原管,經(jīng)過四輪“吸附—洗脫—擴增”的淘篩過程篩選特異性抗體,獲得26個結(jié)合DPK3及31個結(jié)合DPK4的克隆,抗體可變區(qū)基因指紋分析分別有5種和21種不同的可變區(qū)片段;將抗體基因轉(zhuǎn)化E.coli HB2151成功制備了可溶性抗體,并應用ELISA方法做了抗原結(jié)合活性鑒定,最終得到抗DPK3的2個單鏈抗體和抗DPK4的5個單鏈抗體�？贵w可變區(qū)基因測序后,經(jīng)與輕鏈(κ鏈和λ鏈)及重鏈抗體數(shù)據(jù)庫的比對,得出抗DPK3抗體基因(1、2)的重鏈可變區(qū)基因分屬VH3、VH4亞群,輕鏈可變區(qū)同屬于VL2亞群;抗DPK4抗體基因重鏈可變區(qū)基因(1、2、5、8、10)分屬VH1、VH3亞群,輕鏈可變區(qū)分屬于VL1、VL2亞群。 3、應用Western Blotting檢測anti-DPK3-scFv-2可溶性抗體的特異性,并與商品化抗DNA-PKcs兔多克隆抗體相比,結(jié)果顯示所篩選獲得的抗DPK3單鏈抗體特異的與DPK3片段結(jié)合而不與DPK4片段結(jié)合,并能結(jié)合細胞內(nèi)DNA-PKcs蛋白,且其特異性較商品化抗體高。 4、將anti-DPK3-scFv-2的基因序列插入真核表達載體pcDNATM3.1 /myc-His B,通過真核轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定表達anti-DPK3-scFv基因的HeLa細胞系。通過克隆形成實驗確定HeLa-DPK3-scFv-2細胞系的輻射敏感性最強,以此細胞系進行了細胞內(nèi)抗體功能實驗。細胞增殖實驗結(jié)果表明,表達anti-DPK3-scFv的腫瘤HeLa細胞的增殖能力受到了抑制。細胞克隆形成實驗的結(jié)果表明表達anti-DPK3-scFv基因的HeLa細胞的輻射敏感性明顯增加。說明細胞內(nèi)抗DPK3抗體對輻射細胞的存活發(fā)揮了阻抑作用,增強了輻射敏感性。中性單細胞凝膠電泳以及γH2AX位點的檢測都證明, anti-DPK3-scFv降低了輻射誘導的HeLa細胞的DNA雙鏈斷裂修復能力。細胞caspase-3活性檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染anti-DPK3-scFv基因的HeLa細胞照射后caspase-3活性與對照相比明顯增高,表明輻射誘導HeLa-DPK3-scFv細胞凋亡增加,該細胞輻射敏感性增強。 5、應用Western Blotting檢測各細胞DNA-PKcs表達,結(jié)果表明anti-DPK3-scFv并不影響細胞內(nèi)DNA-PKcs的表達。進一步檢測細胞內(nèi)DNA-PKcs的磷酸化底物Akt的磷酸化水平,結(jié)果顯示HeLa-DPK3-scFv細胞經(jīng)γ射線照射后Akt的磷酸化水平?jīng)]有明顯改變,表明HeLa-DPK3-scFv受照發(fā)生DNA損傷后,DNA-PKcs不能相應的激活下游的效應蛋白,不能完成對DNA損傷的修復,因而DSB修復受阻。 綜上所述,本課題獲得了DNA-PKcs中抗原性高且與其他蛋白沒有同源性的蛋白片段,經(jīng)原核表達及蛋白純化得到DPK3、DPK4蛋白片段;采用噬菌體抗體庫等平臺,分別篩選鑒定了DPK3、DPK4的特異性抗體,首次獲得針對人DNA-PKcs的單鏈人源抗體;并在HeLa細胞表達所篩選的抗DPK3單鏈抗體,研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染anti-DPK3-scFv的HeLa細胞增殖能力下降、輻射敏感性增強,DNA損傷修復能力受到抑制。這可能是由于細胞內(nèi)表達的該單鏈抗體通過結(jié)合于DNA-PKcs表面某個蛋白相互作用位點,或是通過與DNA-PKcs的結(jié)合改變了DNA-PKcs的構(gòu)象,從而阻礙了其參與DNA雙鏈斷裂的NHEJ修復過程,增強了細胞的輻射敏感性。本研究為進一步的腫瘤輻射增敏應用研究打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392;R730.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 嚴雨倩;周平坤;;哺乳動物細胞DNA非同源末端連接及其生物學意義[J];醫(yī)學分子生物學雜志;2006年01期

2 江國春,袁麗珍;DNA依賴蛋白激酶研究進展[J];生物化學與生物物理進展;1999年06期

3 黃強;陳利弘;曾令宇;萬琳;李勝富;盧曉風;程驚秋;;大腸桿菌表達的人源性抗CTLA4單鏈抗體三種復性方法比較[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2006年02期

4 余子建;徐勤枝;周麗君;隋建麗;張士猛;安靜;王豫;周平坤;;肝癌組織DNA-PKcs過量表達及其靶向siRNA分子的抗增殖作用[J];世界華人消化雜志;2007年36期

5 余子建,隋建麗,丁映欽,曹珍山,周平坤,吳德昌;肝膽腫瘤組織中DNA依賴蛋白激酶的表達及意義[J];中華肝臟病雜志;2004年11期

6 喬媛媛,王琰,陳曉穗,王欲曉,化冰;大容量噬菌體抗體庫的構(gòu)建及鑒定[J];中華微生物學和免疫學雜志;2004年03期

7 喬媛媛;王欲曉;周麗君;趙宇;王玉霞;趙曉航;王琰;;從大容量抗體庫中篩選抗蓖麻毒蛋白抗體[J];中國免疫學雜志;2007年10期

8 隋建麗,孫敬芬,曹珍山,周平坤 ,吳德昌;DNA依賴蛋白激酶在人支氣管上皮細胞癌變株和肺癌組織中的異常表達[J];中國體視學與圖像分析;2003年03期

，

本文編號：1635605