本文選題：DNA依賴的蛋白激酶催化亞基　切入點(diǎn)：腫瘤　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類健康。放射治療是惡性腫瘤主要治療手段之一。然而,放療可導(dǎo)致腫瘤周圍正常組織受損,從而導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用,同時(shí),部分腫瘤細(xì)胞具有耐放射的生物學(xué)特性,或在放療過程中,使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)耐受性,導(dǎo)致治療效果降低。目前,如何降低放療劑量、提高治療效果、減少腫瘤細(xì)胞耐受,即增強(qiáng)腫瘤放療的輻射敏感性已成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。 放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)主要是通過誘發(fā)其DNA雙鏈斷裂(DNA double- strand breaks, DSBs),從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞程序性死亡或壞死。出現(xiàn)DSB后,細(xì)胞會(huì)對(duì)其修復(fù),以保證基因組結(jié)構(gòu)的完整性,這也是腫瘤細(xì)胞抵抗放療的主要機(jī)制之一,DNA修復(fù)能力越強(qiáng),對(duì)放射的抗性越突出。哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)DSB損傷修復(fù)主要有非同源末端連接(nonhomologous end-jioning,NHEJ)和同源重組(homologous recombination,HR)兩條途徑。DNA依賴的蛋白激酶復(fù)合物(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)是NHEJ途徑中重要的組成成分。該復(fù)合物由調(diào)節(jié)亞單位Ku70/Ku80異源二聚體和催化亞基DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)組成。DNA-PKcs通過自磷酸化及磷酸化其他效應(yīng)蛋白如XRCC-4、Artemis,在DSB修復(fù)中發(fā)揮重要作用。另外,DNA-PKcs還參與細(xì)胞周期G2期調(diào)控及細(xì)胞凋亡和自吞噬死亡,還可參與V(D)J重組過程、維護(hù)端粒長度。近年來,研究表明DNA-PKcs在多種類型癌組織細(xì)胞中普遍高表達(dá),具有高轉(zhuǎn)移特性和放化療抗性的癌細(xì)胞中DNA-PKcs的表達(dá)活性顯著增高;特異性抑制DNA-PKcs導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)γ射線及紫外線的敏感性增加,DNA-PKcs表達(dá)沉默細(xì)胞的生長速度和接種裸鼠后形成腫瘤的生長速度減慢,顯示DNA-PKcs具有作為放射增敏抗癌分子靶標(biāo)的重要價(jià)值。 目前已有多種方式用以抑制DNA-PKcs功能,如典型的PI3K抑制劑渥漫青霉素(Wortmannin)、LY294002,特異的DNA-PKcs抑制劑OK-1035、NU7026,反義寡核苷酸,單克隆抗體以及Ku片段等。然而這些抑制劑或特異性較差、或用于機(jī)體可導(dǎo)致肝毒性或引起免疫反應(yīng),限制其實(shí)際應(yīng)用。近年來隨著人源抗體制備技術(shù)尤其是通過噬菌體抗體庫篩選單鏈抗體技術(shù)的發(fā)展,為惡性腫瘤治療的生物制藥提供了新的技術(shù)方法。目前通過抑制DNA-PKcs用以增強(qiáng)腫瘤放療敏感性的實(shí)用藥物尚未上市,而針對(duì)DNA-PKcs的單鏈抗體制備未見有報(bào)道。 本研究通過噬菌體抗體庫技術(shù)篩選DNA-PKcs單鏈抗體,用以增加腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的研究。獲得如下主要結(jié)果: 1、應(yīng)用生物信息學(xué)分析軟件Biosun對(duì)DNA-PKcs蛋白進(jìn)行了抗原性分析,通過BLAST比對(duì)確定了抗原性高、且與其他蛋白沒有同源性的蛋白片段DPK1、DPK2、DPK3及DPK4;RT-PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因序列,構(gòu)建原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3),經(jīng)優(yōu)化表達(dá)條件以包涵體形式成功表達(dá)出250個(gè)氨基酸的DPK3和257個(gè)氨基酸的DPK4蛋白片段,經(jīng)過包涵體蛋白變性、復(fù)性得到純化的DPK3、DPK4。 2、采用海軍總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室建立的天然大容量噬菌體抗體庫,篩選針對(duì)DPK3、DPK4的特異性單鏈人源抗體。將一定濃度的純化可溶性蛋白DPK3、DPK4分別包被抗原管,經(jīng)過四輪“吸附—洗脫—擴(kuò)增”的淘篩過程篩選特異性抗體,獲得26個(gè)結(jié)合DPK3及31個(gè)結(jié)合DPK4的克隆,抗體可變區(qū)基因指紋分析分別有5種和21種不同的可變區(qū)片段;將抗體基因轉(zhuǎn)化E.coli HB2151成功制備了可溶性抗體,并應(yīng)用ELISA方法做了抗原結(jié)合活性鑒定,最終得到抗DPK3的2個(gè)單鏈抗體和抗DPK4的5個(gè)單鏈抗體�？贵w可變區(qū)基因測(cè)序后,經(jīng)與輕鏈(κ鏈和λ鏈)及重鏈抗體數(shù)據(jù)庫的比對(duì),得出抗DPK3抗體基因(1、2)的重鏈可變區(qū)基因分屬VH3、VH4亞群,輕鏈可變區(qū)同屬于VL2亞群;抗DPK4抗體基因重鏈可變區(qū)基因(1、2、5、8、10)分屬VH1、VH3亞群,輕鏈可變區(qū)分屬于VL1、VL2亞群。 3、應(yīng)用Western Blotting檢測(cè)anti-DPK3-scFv-2可溶性抗體的特異性,并與商品化抗DNA-PKcs兔多克隆抗體相比,結(jié)果顯示所篩選獲得的抗DPK3單鏈抗體特異的與DPK3片段結(jié)合而不與DPK4片段結(jié)合,并能結(jié)合細(xì)胞內(nèi)DNA-PKcs蛋白,且其特異性較商品化抗體高。 4、將anti-DPK3-scFv-2的基因序列插入真核表達(dá)載體pcDNATM3.1 /myc-His B,通過真核轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定表達(dá)anti-DPK3-scFv基因的HeLa細(xì)胞系。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)確定HeLa-DPK3-scFv-2細(xì)胞系的輻射敏感性最強(qiáng),以此細(xì)胞系進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)抗體功能實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,表達(dá)anti-DPK3-scFv的腫瘤HeLa細(xì)胞的增殖能力受到了抑制。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明表達(dá)anti-DPK3-scFv基因的HeLa細(xì)胞的輻射敏感性明顯增加。說明細(xì)胞內(nèi)抗DPK3抗體對(duì)輻射細(xì)胞的存活發(fā)揮了阻抑作用,增強(qiáng)了輻射敏感性。中性單細(xì)胞凝膠電泳以及γH2AX位點(diǎn)的檢測(cè)都證明, anti-DPK3-scFv降低了輻射誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力。細(xì)胞caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染anti-DPK3-scFv基因的HeLa細(xì)胞照射后caspase-3活性與對(duì)照相比明顯增高,表明輻射誘導(dǎo)HeLa-DPK3-scFv細(xì)胞凋亡增加,該細(xì)胞輻射敏感性增強(qiáng)。 5、應(yīng)用Western Blotting檢測(cè)各細(xì)胞DNA-PKcs表達(dá),結(jié)果表明anti-DPK3-scFv并不影響細(xì)胞內(nèi)DNA-PKcs的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA-PKcs的磷酸化底物Akt的磷酸化水平,結(jié)果顯示HeLa-DPK3-scFv細(xì)胞經(jīng)γ射線照射后Akt的磷酸化水平?jīng)]有明顯改變,表明HeLa-DPK3-scFv受照發(fā)生DNA損傷后,DNA-PKcs不能相應(yīng)的激活下游的效應(yīng)蛋白,不能完成對(duì)DNA損傷的修復(fù),因而DSB修復(fù)受阻。 綜上所述,本課題獲得了DNA-PKcs中抗原性高且與其他蛋白沒有同源性的蛋白片段,經(jīng)原核表達(dá)及蛋白純化得到DPK3、DPK4蛋白片段;采用噬菌體抗體庫等平臺(tái),分別篩選鑒定了DPK3、DPK4的特異性抗體,首次獲得針對(duì)人DNA-PKcs的單鏈人源抗體;并在HeLa細(xì)胞表達(dá)所篩選的抗DPK3單鏈抗體,研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染anti-DPK3-scFv的HeLa細(xì)胞增殖能力下降、輻射敏感性增強(qiáng),DNA損傷修復(fù)能力受到抑制。這可能是由于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的該單鏈抗體通過結(jié)合于DNA-PKcs表面某個(gè)蛋白相互作用位點(diǎn),或是通過與DNA-PKcs的結(jié)合改變了DNA-PKcs的構(gòu)象,從而阻礙了其參與DNA雙鏈斷裂的NHEJ修復(fù)過程,增強(qiáng)了細(xì)胞的輻射敏感性。本研究為進(jìn)一步的腫瘤輻射增敏應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392;R730.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1635605