本文選題：惡性瘧原蟲　切入點：基因合成　出處：《中國疾病預(yù)防控制中心》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：瘧疾嚴(yán)重威脅人們的健康,是全球重要的公共衛(wèi)生問題,迫切需要采用高新技術(shù)尋求新的瘧疾防治方法以控制流行。研制有效的瘧疾疫苗是控制瘧疾的主要措施之一,在這方面已有大量的研究和臨床試驗報道。瘧疾主要流行于發(fā)展中國家或經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū),即使瘧疾疫苗研發(fā)成功,如果價格高,也將是阻礙疫苗廣泛應(yīng)用的主要原因。轉(zhuǎn)基因植物是有希望滿足疫區(qū)條件的疫苗生產(chǎn)系統(tǒng)及投遞系統(tǒng)。本研究利用轉(zhuǎn)基因植物表達了惡性瘧原蟲3D7株裂殖子表面蛋白1 C末端基因(msp1-42),并對表達蛋白的抗原性和免疫原性進行了研究,取得以下結(jié)果。 1根據(jù)水稻偏愛的密碼子重新設(shè)計了msp1-42基因序列,分別合成23對引物,采用兩步PCR法拼接合成了完整的msp1-42基因。 2為了檢驗合成的msp1-42基因能否在大腸桿菌中表達,并獲得異源表達系統(tǒng)表達的MSP1-42抗原用于后續(xù)研究,對全合成的惡性瘧原蟲3D7株msp1-42基因起始密碼子后的12個氨基酸用大腸桿菌偏愛的密碼子進行改造(命名為Emsp1-42)后,構(gòu)建至pET32a(+)表達載體,獲得pET32amsp表達質(zhì)粒,熱激轉(zhuǎn)化至有利于二硫鍵形成和增加蛋白可溶性的宿主菌Rosetta-gami(DE3)中,在25℃條件下進行誘導(dǎo)表達。結(jié)果從培養(yǎng)物上清中獲得可溶性的eMSP1-42蛋白,純化后條帶均一,無其他雜蛋白;所獲得的eMSP1-42蛋白能與識別MSP1-19構(gòu)象表位的特異性單克隆抗體mAb5.9、PfCP2.9免疫兔血清以及惡性瘧患者混合血清反應(yīng)。用eMSP1-42與福氏佐劑免疫新西蘭兔制備的免疫血清,能識別惡性瘧原蟲天然的抗原;可抑制體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲(Hcc1/HN,海南分離株)生長,3只兔10%濃度免疫血清的原蟲抑制率依次為(51.9±24.2)%、(29.4±8.6)%和(86.7±7.4)%,20%濃度的抑制率依次為(93.3±7.5)%、(65.3±10.6)%和(96.4±1)%。表明所合成的Emsp1-42基因能在大腸桿菌中表達,所表達的重組蛋白eMSP1-42具有抗原性和免疫原性。 3為了探索研制瘧疾植物口服疫苗的可行性,在水稻種子中表達惡性瘧原蟲(3D7株)主要表面蛋白C末端MSP1-42蛋白。將已按水稻偏愛的密碼子重新合成的msp1-42基因(Rmsp1-42)與胚乳特異性表達的水稻種子儲存蛋白麥谷蛋白基因的啟動子GluB-4連接后,構(gòu)建至植物雙元表達載體pCAMBIA1300,獲得p1300Gmsp表達質(zhì)粒;將p1300Gmsp表達質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105,由農(nóng)桿菌介導(dǎo)使Rmsp1-42插入水稻基因組DNA中,獲得轉(zhuǎn)基因水稻;采用PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株,用ELISA、免疫印跡法和原位Western印跡等方法檢測水稻種子中表達的MSP1-42蛋白(rMSP1-42),用鎳柱純化rMSP1-42蛋白,與等體積的福氏佐劑乳化后,采用皮下注射方式免疫新西蘭兔,制備免疫兔血清,用ELISA和IFA檢測免疫血清中的特異性抗體,采用10%、20%的免疫血清體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲,評價其體外抑制惡性瘧原蟲生長的效果。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)所合成的惡性瘧原蟲3D7株Rmsp1-42基因在水稻種子中獲得了高表達,產(chǎn)量為189.56μg/g種子干重(56 g轉(zhuǎn)基因種子可純化出10.62 mg rMSP1-42蛋白),由此推算的rMSP1-42蛋白在種子中的表達量約為總可溶性蛋白的1.56%。所產(chǎn)生的重組蛋白能與識別MSP1-42 C末端構(gòu)象表位的mAb5.2單抗、PfCP2.9兔血清及惡性瘧患者混合血清反應(yīng),皮下免疫新西蘭兔能誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生,免疫血清能識別惡性瘧原蟲天然的抗原;不同濃度的免疫血清均具有體外抑制瘧原蟲生長的作用,其抑制作用隨免疫血清濃度的增加而增強,在10%濃度時,3只兔的抑制率依次為(18.2±8.5)%、(47.7±7.5)%和(40.6±9.7)%,20%濃度的抑制率依次為(77.3±7.5)%、(87.6±4.7)%和(87.2±3.7)%,說明在水稻種子中表達的rMSP1-42重組蛋白具有抗原性和免疫保護性,是潛在的用于生產(chǎn)瘧原蟲抗原的生產(chǎn)系統(tǒng)。 4嘗試將msp1-42基因轉(zhuǎn)化至煙草葉綠體基因組中表達。對合成的msp1-42基因起始密碼子后的12個氨基酸利用煙草偏愛的密碼子優(yōu)化,設(shè)計正反引物,從含msp1-42基因的pBluntmsp質(zhì)粒中擴增出Cmsp1-42,構(gòu)建煙草葉綠體表達載體LRrrmsp,通過基因槍轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草葉片,在500 mg/L壯觀霉素的選擇下篩選轉(zhuǎn)基因植株,采用PCR鑒定壯觀霉素抗性植株,確認(rèn)已將Cmsp1-42基因?qū)霟煵萑~綠體基因組中,獲得轉(zhuǎn)基因煙草。采用多重PCR分析表明經(jīng)3次分化篩選后獲得的植株尚未完全同質(zhì)化。ELISA檢測煙草葉片總蛋白中的cMSP1-42蛋白呈陰性反應(yīng)。是mRNA不穩(wěn)定還是表達出的蛋白被降解而導(dǎo)致cMSP1-42蛋白在煙草中不能積聚,還有待做進一步的分析。
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【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

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