發(fā)布時間：2018-03-19 14:21

  本文選題：細胞芯片　切入點：CD抗體　出處：《中國醫(yī)科大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 目的 腫瘤標志物(tumor marker, TM),是指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中,由腫瘤細胞所產(chǎn)生或分泌并釋放到血液、體液中,反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)。腫瘤標志物可以分成以下幾大類：①腫瘤胚胎性抗原；②酶和同工酶；③血漿蛋白；④細胞代謝產(chǎn)物；⑤腫瘤抗原；⑥癌基因和抑癌基因蛋白產(chǎn)物及微量元素。腫瘤抗原(tumor antigen)泛指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中新出現(xiàn)或者過度表達的一些抗原物質(zhì)。 免疫應答過程有賴于免疫系統(tǒng)中細胞間的相互作用,一種是通過細胞間的直接接觸,另一種是通過分泌細胞因子或其他活性分子而介導的相互作用。細胞表面功能分子是免疫細胞之間相互識別的物質(zhì)基礎,包括細胞表面的多種抗原、受體和其他分子。應用單克隆抗體鑒定為主的方法,將來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一分化抗原決定簇,統(tǒng)稱為CD (cluster of differentiation)。些研究者研究發(fā)現(xiàn),正常細胞和腫瘤細胞所表達的CD抗原不同,并且CD與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系。 本課題研究制備的細胞芯片就是用來高通量檢測細胞表面CD抗原的表達情況。將六十四種CD抗原單克隆抗體固定于載體上,首先形成抗體點陣,隨后利用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理,不同的單克隆抗體能夠自動識別和捕獲表達相應表面分化抗原的細胞,從而檢測多種腫瘤細胞表面相應CD表型的表達情況。細胞芯片技術(shù)可快速地分析正常與癌細胞表面CD抗原表型的差異,不僅有助于腫瘤發(fā)病機制的闡明,還能篩選腫瘤細胞CD抗原表型標志物,在腫瘤的發(fā)生機制研究、診斷和治療方面,具有廣闊的應用前景。 方法 1、細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)9種細胞備用,人正常胃粘膜細胞系GES-1、人胃腺癌細胞系7901、人正常肝上皮細胞系L-02、人肝癌細胞系Bel7404、人胰腺癌細胞系PANC-1、人小細胞肺癌細胞系H446、人大細胞肺癌細胞系H460、人肺腺癌細胞系A549和人大腸癌細胞系HT29； 2、應用細胞芯片捕獲腫瘤細胞并檢測其細胞表面CD抗原表型的表達； 3、驗證細胞芯片檢測腫瘤細胞表面CD抗原表型表達的特異性； (1)應用RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)方法驗證細胞芯片對人正常胃粘膜細胞系GES-1、人胃腺癌細胞系7901和人胰腺癌細胞系PANC-1細胞表面CD抗原表型的檢測結(jié)果； (2)基因測序驗證人正常胃粘膜細胞系GES-1、人胃腺癌細胞系7901細胞表面CD抗原表型表達的RT-PCR擴增結(jié)果； (3)應用流式細胞術(shù)驗證細胞芯片捕獲細胞的特異性； 4、細胞芯片陽性點熒光標記CD的篩選。 結(jié)果 1、細胞芯片上CD13、CD29、CD49e、CD55、CD44、CD71、CD95、CD133抗體點捕獲到人小細胞肺癌細胞系H446細胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD133、CD95抗體點捕獲到人大細胞肺癌細胞系H460細胞；CD29、CD44、CD49e、CD55、CD61、CD71、CD133、CD90抗體點捕獲到人肺腺癌細胞系A549細胞；CD9、CD15、CD24、CD29、CD44、CD55、CD66、CD31抗體點捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞；CD13、CD29、CD44、CD55、CD71抗體點捕獲到人胰腺癌細胞系PANC-1細胞；CD9、CD13、CD15、CD29、CD49e、CD44、CD55、CD71、CD77抗體點捕獲到人肝癌細胞系Bel7404細胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD56、CD57、CD71抗體點捕獲到人正常肝上皮細胞系L-02細胞；CD9、CD13、CD15、CD24、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95抗體點捕獲到人正常胃粘膜細胞系GES-1細胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95、CD77、CD133、CD103、CD64抗體點捕獲到人胃腺癌細胞系7901細胞。 2、RT-PCR檢測人胃腺癌細胞系7901和人正常胃粘膜細胞系GES-1 CD表型mRNA的表達,結(jié)果顯示7901和GES-1均有CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95的表達,與我們的細胞芯片檢測CD表型的結(jié)果相一致；RT-PCR檢測人胰腺癌細胞系PANC-1 CD表型：nRNA的表達,結(jié)果顯示CD71、CD55均有表達,與我們的細胞芯片檢測CD表型的結(jié)果相一致。 3、應用流式細胞術(shù)的方法,檢測人胃癌細胞系7901與人胃正常細胞系GES-1細胞表面CD15、CD24、CD44的表達,流式結(jié)果顯示與我們的細胞芯片檢測CD表型的結(jié)果相一致。 4、從FITC-CD14、FITC-CD4、PE-CD3、FITC-CD19、PE-Cy5-CD19、FITC-Cy5-CD2、FITC-CD3、Cy-Chrome-CD22和PE-CD14等9種熒光標記的CD中,篩選最佳細胞芯片陽性標點,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PE-CD13效果最好。 結(jié)論 1、細胞芯片CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD133抗體點均捕獲人小細胞肺癌細胞系H446細胞、人大細胞肺癌細胞系H460細胞和人肺腺癌細胞系A549細胞；CD13、CD95抗體點捕獲到人小細胞肺癌細胞系H446細胞和人大細胞肺癌細胞系H460細胞,未捕獲到人肺腺癌細胞系A549細胞；CD9抗體點僅捕獲到人大細胞肺癌細胞系H460細胞,未捕獲到人小細胞肺癌細胞系H446細胞和人肺腺癌細胞系A549細胞；CD61、CD90抗體點僅捕獲到人肺腺癌細胞系A549細胞,未捕獲到人小細胞肺癌細胞系H446細胞和人大細胞肺癌細胞系H460細胞。 2.、細胞芯片CD29、CD44、CD55、CD71抗體點均捕獲到消化系腫瘤細胞系細胞,人大腸癌細胞系HT29細胞、人胰腺癌細胞系PANC-1細胞、人胃腺癌細胞系7901細胞和人肝癌細胞系Bel7404細胞；CD9抗體點捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞、人胃腺癌細胞系7901細胞和人肝癌細胞系Bel7404細胞,未捕獲到人胰腺癌細胞系PANC-1細胞；CD13抗體點捕獲到人胰腺癌細胞系PANC-1細胞、人胃腺癌細胞系7901細胞和人肝癌細胞系Bel7404細胞,未捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞；CD15抗體點捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞和人肝癌細胞系Bel7404細胞,未捕獲到人胰腺癌細胞系PANC-1細胞和人胃腺癌細胞系7901細胞；CD49e、CD77抗體點捕獲到人胃腺癌細胞系7901細胞和人肝癌細胞系Bel7404細胞,未捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞和人胰腺癌細胞系PANC-1細胞；CD24、CD66、抗體點僅捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞；CD95、CD133、CD103、CD64抗體點僅捕獲到人胃腺癌細胞系7901細胞。 3.、細胞芯片CD29、CD44、CD55、CD71抗體點均捕獲到人小細胞肺癌細胞系H446細胞、人大細胞肺癌細胞系H460細胞、人肺腺癌細胞系A549細胞、人大腸癌細胞系HT29細胞、人胰腺癌細胞系PANC-1細胞、人胃腺癌細胞系7901細胞和人肝癌細胞系Be17404細胞。 4、細胞芯片CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71抗體點捕獲到人肝癌細胞系Be17404細胞和人正常肝上皮細胞系L-02細胞；CD15、CD77抗體點僅捕獲到人肝癌細胞系Be17404細胞,未捕獲到人肝上皮細胞系L-02細胞；CD56、CD57抗體點僅捕獲到人正常肝上皮細胞系L-02細胞,未捕獲到人肝癌細胞系Bel7404細胞。 5、細胞芯片CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95抗體點均捕獲到人正常胃粘膜細胞系GES-1細胞和人胃腺癌細胞系7901細胞；CD15、CD24抗體點僅捕獲到人正常胃粘膜細胞系GES-1細胞,未捕獲到人胃腺癌細胞系7901細胞；CD77、CD133、CD103、CD64抗體點僅捕獲到人胃腺癌細胞系7901細胞,未捕獲到人正常胃粘膜細胞系GES-1細胞；CD15和CD24可能是人正常胃粘膜細胞系GES-1細胞的表面標志物,CD77、CD133、CD103、CD64可能是人胃癌細胞系7901細胞的標志物。 6、RT-PCR檢測人胃腺癌細胞系7901和人正常胃粘膜細胞系GES-1 CD表型mRNA的表達,結(jié)果顯示7901和GES-1均有CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD77、CD95 mRNA的表達,與我們的細胞芯片檢測CD表型的結(jié)果相一致；RT-PCR檢測人胰腺癌細胞系PANC-1 CD表型mRNA的表達,結(jié)果顯示CD71、CD55均有表達,與我們的細胞芯片檢測CD表型的結(jié)果相一致。 7、應用流式細胞術(shù)的方法,檢測人胃腺癌細胞系7901與人胃正常細胞系GES-1細胞表面表達CD15、CD24、CD44,結(jié)果顯示,人胃腺癌細胞系7901細胞表面不表達CD15、CD24,表達CD44；人胃正常細胞系GES-1細胞表面表達CD15、CD24、CD44,與我們的細胞芯片檢測CD表型的結(jié)果相一致。 8、確定最佳細胞芯片陽性標點試劑是PE-CD13。
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【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392.12

【參考文獻】

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2 吳廣平,趙雨杰,秦海明,侯偉建,王天嬌,石玉秀;細胞芯片診斷胸腔液中淋巴瘤細胞的初步評價[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2003年04期

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本文編號：1634643