本文選題：Cohn氏法組份Ⅳ　切入點(diǎn)：蛋白C　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的探索建立一種串聯(lián)離子交換層析和固定化金屬螯合親和層析從Cohn氏法組份Ⅳ分離純化蛋白C的方法,降低純化蛋白C的成本,并實(shí)現(xiàn)血漿的綜合利用。 方法4℃條件下,Cohn氏法組份Ⅳ用磷酸鹽緩沖液按1：10(w/v)的比例攪拌抽提5h,離心(6500g,4℃) 40min,上清液依次用0.45μm和0.22μm的濾膜過(guò)濾,按1：10(w/w)比例加入3.3%的TNBP和11%的Tween-80,緩慢攪拌.6h(24℃)。超濾透析后,再通過(guò)串聯(lián)離子交換層析和固定化金屬螯合親和層析,對(duì)蛋白C進(jìn)行純化。通過(guò)SDS-PAGE鑒定蛋白C的純度；通過(guò)Western Blot鑒定蛋白C的特異性；用考馬斯亮藍(lán)法通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定總蛋白含量；通過(guò)WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)指定的發(fā)色底物法和凝固法(一期法)測(cè)定蛋白C活性。 結(jié)果在有機(jī)溶劑/去污劑病毒滅活過(guò)程中,0.1mol/L的組氨酸和2.5%的人血清白蛋白能使蛋白C的活性保持在85%以上。純化的蛋白C在SDS-PAGE圖譜上呈現(xiàn)一條62kD左右的蛋白帶,Western Blot檢測(cè)顯陽(yáng)性。經(jīng)過(guò)離子交換層析,蛋白C的活性回收率為(48.19±9.22)%,純化倍數(shù)為(3.75±0.56)倍；固定化金屬螯合親和層析后,蛋白C活性回收率為(59.61±5.59)%,純化倍數(shù)為(36.79±3.72)倍；經(jīng)過(guò)兩步層析后,蛋白C總活性回收率為(28.77±9.45)%,純化倍數(shù)為(136.64±6.82)倍,比活性為(11.70±0.89)IU/mg. 結(jié)論組氨酸和人血清白蛋白可以作為有機(jī)溶劑／去污劑滅活脂包膜病毒過(guò)程中蛋白C的一種很有效的保護(hù)劑。串聯(lián)離子交換層析和固定化金屬螯合親和層析可以從Cohn氏法組份Ⅳ中獲得比活性較高的蛋白C濃縮物,能顯著降低成本,實(shí)現(xiàn)血漿的綜合利用。
[Abstract]:Objective to establish a series ion exchange chromatography and immobilized metal chelating affinity chromatography for the separation and purification of protein C from component 鈪，

本文編號(hào)：1628872