本文選題：胰島素抵抗　切入點(diǎn)：2型糖尿病　出處：《中國疾病預(yù)防控制中心》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 研究背景 隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們膳食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變,糖尿病(diabetes,DM)已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病。飲食和營養(yǎng)治療是糖尿病治療的重要組成部分。通過膳食和保健食品預(yù)防和控制糖尿病成為一種趨勢。輔助降血糖保健食品主要是天然植物性食品或提取物,其來源廣泛,降糖效果和作用機(jī)理也不盡相同,這些因素給功能性食品評價帶來挑戰(zhàn)。目前的保健食品評價標(biāo)準(zhǔn)僅給出一種類似1型DM的化學(xué)誘導(dǎo)動物模型,顯然不能滿足當(dāng)前保健食品多樣化發(fā)展的要求。為了適應(yīng)功能食品評價的發(fā)展要求,科技部提出了功能性食品評價技術(shù)的研究的十一五課題。近年有人考慮膳食在糖尿病發(fā)病進(jìn)程中的因素,提出膳食誘導(dǎo)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)的造模方法。但是這種模型的造模條件,高脂飼料配方、高脂喂養(yǎng)時間和STZ注射劑量等缺少統(tǒng)一的操作,此外該模型的代謝特征,以及在評價不同來源、不同作用機(jī)理的輔助降糖功能食品中的應(yīng)用性還未見較系統(tǒng)的研究。因此,針對這些問題我們在以往研究中主要對造模方法進(jìn)行了初步探討,本研究主要從模型血生化代謝特點(diǎn)、組織形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征,從整體到組織再到細(xì)胞水平全方位深入研究該模型是否具有2型糖尿病特點(diǎn)；并通過促胰島素分泌劑和胰島素增敏劑藥物進(jìn)行驗(yàn)證和評估該模型的胰島素抵抗水平和β細(xì)胞功能；最后在具體的功能食品評價中對該模型的應(yīng)用性進(jìn)行探討。 研究目的 1.建立高脂高糖飼料聯(lián)合小劑量STZ制造2型DM實(shí)驗(yàn)動物模型,并探討其模型特征； 2.通過重復(fù)性研究和藥物評價驗(yàn)證模型的可復(fù)制性和適用性 3.模型在表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)和葛根黃酮,不同來源和不同機(jī)制的功能性食品降血糖評價中的適用性 方法： 1、2型糖尿病大鼠最佳造模條件確立 1.1飼料中豬油、蔗糖配比對造模的影響 55只大鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為普通飼料組(N)和高脂高糖飼料組(HFS)。HFS飼料依據(jù)豬油(F)、蔗糖(S)水平設(shè)計為1OF10S(含10%豬油10%蔗糖,其余類推)、10F20S、20F10S組。觀察每組大鼠8周內(nèi)體重、空腹血糖(FBG)和葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)后2h血糖(PBG)、血脂水平變化。然后,HFS喂養(yǎng)大鼠腹腔注射25 mg/kg STZ,對照組同法注射緩沖液。觀察大鼠飲食、飲水、排尿量、毛色、體重變化及死亡情況；注射后連續(xù)2周觀察FBG、PBG的穩(wěn)定性,確立適宜飼料配方。 1.2 STZ注射劑量對造模的影響 75只大鼠根據(jù)體重、血糖水平隨機(jī)分為6組：正常對照組(10只)、普通飼料STZ組(15只)、高脂對照組(10只)、低劑量STZ組(15只)、中劑量STZ組(15只)、高劑量STZ組(15只)。正常對照組和普通飼料STZ組給予普通飼料,其余組給予10F20S飼料。喂養(yǎng)8周后,分別一次性腹腔注射0、25、0、20、25、30mg/kg,bw STZ。繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng),觀察大鼠飲食、飲水、排尿量、毛色變化,記錄每周體重變化、死亡情況；連續(xù)監(jiān)測7wFBG、PBG變化,確定血糖穩(wěn)定情況和成模率,根據(jù)血糖水平以及胰島組織形態(tài)學(xué)檢測確立最適造模條件。 2、2型糖尿病大鼠模型可復(fù)制性及特征研究 選擇75只健康雄性Wistar大鼠按照以上確立的條件(10F20S喂養(yǎng)+25mg/kg,bw STZ)造模。另選正常對照組(N組)10只和高脂飼料對照組(HF組)10只。HFS喂飼8周后測定FBG、PBG、空腹INS、TG、TC、ISI,確立胰島素抵抗發(fā)生。 然后STZ造模,2周后篩選糖尿病模型大鼠；繼續(xù)喂養(yǎng)5周后處死。觀測血生化指標(biāo)：ALT、AST、CR、LDL、HDL、TG、TC、GLU、INS;組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)：胰腺、肝、腎、心組織的HE染色,胰島的p細(xì)胞的胰島素免疫組織化學(xué)；胰島素信號傳導(dǎo)指標(biāo)：各組大鼠肝臟和肌肉中胰島素信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白InsR、IRS、PPARγ的表達(dá)情況,確立模型特征。通過統(tǒng)計學(xué)分析確立模型的可復(fù)制性。 3、2型糖尿病大鼠模型的驗(yàn)證 分別以胰島素促分泌劑瑞格列奈和胰島素增敏劑羅格列酮為陽性對照物對上述模型大鼠的胰島素抵抗水平和p細(xì)胞功能進(jìn)行評估和驗(yàn)證。 挑選正常對照組(N組)大鼠10只；以及2型糖尿病造模成功的大鼠27只,根據(jù)血糖隨機(jī)分為3組,每組9只,各組每天分別給予空白對照(蒸餾水)、胰島素促進(jìn)劑瑞格列奈(1mg/kg)、胰島素增敏劑羅格列酮(0.5mg/kg)灌胃(分別為DM組、Rep組、Ros組)。連續(xù)喂養(yǎng)5周,再次進(jìn)行OGTT試驗(yàn)后,取血并處死大鼠。從血生化指標(biāo)、組織形態(tài)學(xué)、胰島素信號傳導(dǎo)三個方面評價瑞格列奈和羅格列酮的作用特征,具體指標(biāo)同上。 4、2型糖尿病大鼠模型在輔助降糖功能性食品評價中的應(yīng)用 4.1葛根素對2型糖尿病大鼠的影響及其作用機(jī)制研究 挑選正常對照組(N組)大鼠10只；以及2型糖尿病造模成功的大鼠36只,根據(jù)PBG和FBG隨機(jī)分為4組,模型對照組(DM組,蒸餾水灌胃)、葛根素低劑量組(P1組,葛根素50mg/kg灌胃)、中劑量組(P2組,100mg/kg)、高劑量(P3組,200mg/kg)。5周后進(jìn)行OGTT試驗(yàn),取血并處死大鼠。檢測血清ALT、AST、CR、LDL、HDL、TG、TC、GLU、INS;總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase, T-SOD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平；胰腺、肝、腎、心等組織的HE染色,胰島的p細(xì)胞的胰島素免疫組織化學(xué)；各組大鼠肝臟和肌肉中InsR、IRS、PPARγ、NF-κB蛋白的表達(dá)情況。通過抗氧化水平、炎癥信號傳導(dǎo)和胰島素信號傳導(dǎo)等方面研究葛根素的降血糖作用,并探討其可能的作用機(jī)制。 4.2表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對2型糖尿病大鼠的預(yù)防作用 挑選正常對照組(N組)大鼠10只；以及胰島素抵抗模型大鼠40只,根據(jù)血糖隨機(jī)分為4組,分別為HFS對照組(H組)、EGCG低劑量(E1)、中(E2)、高劑量組(E3)。 EGCG一次性降血糖作用：N組、H組、E1組、E2組和E3組分別給予蒸餾水、蒸餾水、200mg/kgEGCG、700mg/kgEGCG、1000mg/kgEGCG一次性灌胃。20 min后進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn),計算OGTT曲線下面積(area under the curve, AUC),觀察EGCG對血糖應(yīng)答的影響。 EGCG干預(yù)10天后降血糖作用：N組、H組、E1組、E2組和E3組大鼠分別給予蒸餾水、蒸餾水、EGCG低劑量(20mg/kg)、EGCG中劑量(50mg/kg)、EGCG高劑量(200mg/kg)灌胃。EGCG干預(yù)10天后,進(jìn)行OGTT試驗(yàn),計算OGTT-AUC。 EGCG干預(yù)5周后降血糖作用：按照短期實(shí)驗(yàn)使用劑量,用EGCG干預(yù)5周測定OGTT,計算OGTT-AUC.然后各組大鼠乙醚麻醉,腹主動脈取血測定ALT、AST、CR、LDL、HDL、TG、TC、GLU、INS;進(jìn)行胰腺、肝、腎、心組織的HE染色,觀察EGCG對大鼠發(fā)生胰島素抵抗的影響。 結(jié)果： 1、2型糖尿病大鼠模型的建立 1.1飼料中豬油、蔗糖配比對造模的影響 高脂喂養(yǎng)至第8周,各HFS組出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象。體重已經(jīng)超出N組10%,但HFS組間未見統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。和對照組相比,HFS各組的PBG均有所升高(P0.05),胰島素敏感指數(shù)(ISI)下降(P0.05),其中10F20S的ISI值最低,說明10F20S易于誘發(fā)胰島素抵抗。 進(jìn)一步采用小劑量STZ造模,大鼠出現(xiàn)明顯的體重下降、血糖升高(和對照組相比,P0.05)等糖尿病體征,造模2周后血糖趨向穩(wěn)定。和其他組相比,20F10S組血糖升高最明顯(P0.05),其中PBG超過30mmol/L的有4只,同時死亡數(shù)較高；10F20S組血糖升高相對溫和,PBG介于11.1-20mmol/L之間。造模成功率10F20S和20F10S均為73.3%,10F10S為66.6%。說明10F20S組造模成功率較高且血糖中度升高。 1.2 STZ注射劑量對造模的影響 STZ注射劑量與造模后血糖水平明顯相關(guān)。高劑量STZ組血糖顯著升高、胰島素嚴(yán)重缺乏,接近1型糖尿病特征；而普通飼料和低劑量STZ組則血糖升高不明顯(P0.05)。中劑量STZ組血糖中度升高,PBG介于11.1mmol/L-20.0mmol/L之間,具有2型糖尿病血糖特征。 連續(xù)7周的OGTT血糖監(jiān)測顯示：血糖初期波動較大和注射劑量有關(guān),高劑量組血糖上升最多,波動也最大；中劑量組血糖在2周后基本達(dá)到穩(wěn)態(tài),在之后的7周內(nèi)血糖較穩(wěn)定。胰島HE染色和免疫組化染色觀察顯示中劑量STZ組胰島結(jié)構(gòu)完整,p細(xì)胞數(shù)量和INS分泌雖有所減少,但接近正常大鼠。高劑量組胰島則損傷太大,而低劑量組能代償損傷不引起高血糖,均不適合造模。 以上實(shí)驗(yàn)確立飼料配方選擇10%豬油、20%蔗糖,STZ劑量選擇25mg/kg.bw,造模條件最佳。 2、2型糖尿病大鼠模型的可復(fù)制性及其特征研究 8周高脂喂養(yǎng)后大鼠已經(jīng)出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象：大鼠明顯肥胖,體重顯著增加,空腹血糖和餐后血糖升高,ISI明顯低于正常對照組(P0.05)。在隨后15周時的組織形態(tài)學(xué)檢測中可見,胰島增生肥大,p細(xì)胞數(shù)目增多但分泌功能障礙,肝臟出現(xiàn)明顯的小泡樣脂肪變性。胰島素信號傳導(dǎo)途徑中IRS-2和PPARγ蛋白表達(dá)水平顯著下降(P0.05)。 在胰島素抵抗大鼠基礎(chǔ)上小劑量腹腔STZ注射,大鼠出現(xiàn)以下變化：1)FBG(8.14±5.87mmol/L)和PBG(17.23±8.98mmol/L)均溫和升高,胰島素水平與N組無差異,ISI低于N組(P0.05),肝糖原增加為N組的5倍。此外成模率為71.6%,與我們前兩次的73.3%結(jié)果基本一致。2)組織形態(tài)學(xué)檢測：小劑量STZ僅僅特異性損傷了大鼠的胰腺,對其他臟器損傷均較小。肝臟中有小泡樣脂肪變性。胰島數(shù)目雖然相對下降,但結(jié)構(gòu)正常,仍有足夠多的正常β細(xì)胞來維持胰島素的分泌。與人類2型糖尿病前期和早期形態(tài)學(xué)改變相似。3)糖尿病大鼠胰島素傳導(dǎo)途徑障礙：InsR蛋白水平均接近正常組大鼠；外周組織中IRS-2和PPARγ表達(dá)水平顯著下降。證明通過8周高脂喂養(yǎng)和小劑量STZ注射,可成功誘導(dǎo)出與人類2型糖尿病相似的大鼠模型。統(tǒng)計結(jié)果顯示,2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)了類型的造模情況,說明本方法具有可復(fù)制性。 3、2型糖尿病大鼠模型的驗(yàn)證 經(jīng)過胰島素促進(jìn)劑(瑞格列奈)和胰島素增敏劑(羅格列酮)5周灌胃治療后,能夠顯著改善大鼠的FBG和PBG水平(P0.05)；胰島素免疫組化染色顯示羅格列酮和瑞格列奈能提高p細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕色顆粒水平,瑞格列奈對刺激β細(xì)胞胰島素分泌作用稍強(qiáng)于羅格列酮；羅格列酮和瑞格列奈降血糖作用可能與提高外周組織中IRS-2和PPARγ表達(dá)水平相關(guān),羅格列酮在大鼠肝臟中提高PPARγ水平明顯,是瑞格列奈的1.4倍。瑞格列奈通過促進(jìn)β細(xì)胞胰島素分泌,羅格列酮通過改善胰島素抵抗均能降低模型大鼠血糖,從另一個方面證實(shí)了該模型仍有足夠的β細(xì)胞數(shù)量和功能維持正常血糖水平,同時胰島素抵抗是導(dǎo)致模型大鼠高血糖的原因之一。 4、2型糖尿病大鼠模型在輔助降糖功能性食品評價中的應(yīng)用研究 4.1葛根素對2型糖尿病大鼠的影響 葛根素通過5周干預(yù)后,能顯著改善DM大鼠的各項指標(biāo)。 1)血生化指標(biāo)：與糖尿病對照組比較,葛根素能降低糖尿病大鼠的FBG和PBG水平,改善ISI,降低血脂水平,改善肝腎功能,且存在劑量反應(yīng)關(guān)系(P0.05)。 2)組織形態(tài)學(xué)檢測：葛根素干預(yù)后,隨著劑量的增加,胰腺中胰島數(shù)逐漸增多,邊界逐漸變清楚,空泡變性減少,p細(xì)胞數(shù)量和胰島素含量增加,但仍未達(dá)到正常組水平。 3)氧化應(yīng)激：葛根素能夠提高糖尿病大鼠的抗氧化能力,提高SOD水平,同時反應(yīng)機(jī)體氧化產(chǎn)物的8-OHdG和MDA水平則降低(P0.05)。 4)胰島素信號傳導(dǎo)途徑：葛根素抑制外周組織(肝臟、肌肉)中NF-KB水平的表達(dá),減輕外周組織中炎癥過程,改善了胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的IRS-2和PPARγ的表達(dá)(P0.05)。 4.2EGCG對2型糖尿病大鼠的預(yù)防作用 EGCG降血糖效果與其在體內(nèi)作用時間長短有關(guān)。在本研究中,通過分析EGCG三個不同作用時間對血糖的影響：發(fā)現(xiàn)一次口服EGCG對胰島素抵抗大鼠的血糖影響不明顯。連續(xù)10天的干預(yù)后,EGCG的中、高劑量組有改善大鼠糖耐量的趨勢,降低餐后血的作用(P0.05)。隨著干預(yù)期的延長,EGCG作用越明顯。連續(xù)5周EGCG干預(yù)后,EGCG降低血糖的同時(P0.05),改善肝臟脂肪變性,促進(jìn)胰島增生以及改善β細(xì)胞功能。 結(jié)論： 1、確定10%豬油20%蔗糖的高脂膳食喂養(yǎng)8周能建立胰島素抵抗大鼠模型,在此基礎(chǔ)上一次性腹腔注射25 mg/kg,bw STZ能建立2型糖尿病大鼠模型。 2、通過在不同動物飼養(yǎng)中心,不同批次大鼠的造模中證實(shí)該模型有較好的穩(wěn)定性和復(fù)制性。 3、通過對模型大鼠血生化指標(biāo)、組織形態(tài)學(xué)檢測和胰島素信號傳導(dǎo)途徑等特征的研究,發(fā)現(xiàn)該模型具有胰島素抵抗和p細(xì)胞功能障礙等2型DM典型特征。 4、選擇特異性強(qiáng)的陽性藥物——胰島素增敏劑和促胰島素分泌劑進(jìn)行干預(yù),驗(yàn)證該模型確實(shí)存在胰島素抵抗和β細(xì)胞功能下降,并證實(shí)該模型在這兩類作用機(jī)制的功能物質(zhì)中有較好的適用性。 5、該模型在黃酮類葛根素和多酚類EGCG降血糖功能評價應(yīng)用中,證實(shí)模型能夠應(yīng)用于改善胰島素信號傳導(dǎo)、抗氧化、抗炎和抑制α-糖苷酶活性等機(jī)制的降血糖功能評價。 研究同時表明,葛根素降血糖的作用可能與其改善胰島素信號傳導(dǎo),提高機(jī)體抗氧化水平,抑制炎癥信號途徑NF-KB蛋白表達(dá)水平有關(guān)。長期給于EGCG可具有降血糖效果,其作用機(jī)制可能與提高體內(nèi)的抗氧化能力和抑制α-糖苷酶活性有關(guān)。 本研究的創(chuàng)新之處： 1.全面探討了大鼠膳食配比和STZ注射劑量對造模的影響,為解釋模型和標(biāo)化模型提供了依據(jù)。 2.從模型血生化代謝特點(diǎn)、組織形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征,從整體到組織再到細(xì)胞水平全方位深入研究該模型的特征。 3.首次探討了模型的穩(wěn)定性、復(fù)現(xiàn)性,對關(guān)鍵技術(shù)條件進(jìn)行了摸索,為提出功能食品評價動物模型的建議提供了參考。 4.首次初步探討了模型在不同作用機(jī)制的功能食品評價中的應(yīng)用性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R-332;R587.1

【引證文獻(xiàn)】

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