本文選題：音猬因子　切入點(diǎn)：心肌細(xì)胞　出處：《廣州醫(yī)學(xué)院》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 第一部分氧化應(yīng)激對乳鼠心肌細(xì)胞Sonic hedgehog(Shh)表達(dá)的影響 目的: Hedgehog家族是一類分泌信號蛋白,主要調(diào)節(jié)胚胎中多種器官和組織的形成。近年發(fā)現(xiàn)其與成年組織干細(xì)胞增殖、多種癌癥的形成有關(guān)。在小鼠中一共有三種hedgehog基因,分別是Sonic hedgehog (Shh),Indian hedgehog (Ihh)和Desert hedgehog (Dhh),由這三種基因編碼而成的信號都激動同樣一條信號級聯(lián)放大通路。Hh信號傳遞受靶細(xì)胞膜上兩種受體Patched (Ptc)和Smoothened (Smo)的控制。受體Ptc由腫瘤抑制基因Patched編碼,是由12個跨膜區(qū)的單一肽鏈構(gòu)成,能與配體直接結(jié)合,對Hh信號起負(fù)調(diào)控作用。受體Smo由原癌基因Smoothened編碼,與G蛋白偶聯(lián)受體同源,由7個跨膜區(qū)的單一肽鏈構(gòu)成,N端位于細(xì)胞外,C端位于細(xì)胞內(nèi),Smo是Hh信號傳遞所必須的受體。當(dāng)Ptc和Hh結(jié)合以后,解除對Smo的抑制作用,促使Gli蛋白與Costal2,Fused和Fused的抑制因子作用后與微管形成大分子復(fù)合物,使得全長Gli蛋白進(jìn)入核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。已有研究表明Shh與許多血管生成因子有關(guān),能促進(jìn)VEGF的表達(dá),參與血管的生長,對急、慢性心肌缺血模型以及缺血再灌注損傷模型有顯著治療作用;又有研究表明HH在動物糖尿病模型中陰莖海綿體、神經(jīng)、血管等組織中表達(dá)下降,并參與糖尿病模型神經(jīng)及其滋養(yǎng)血管的修復(fù)和皮膚傷口的愈合。我們之前的研究已經(jīng)證實了糖尿病小鼠心肌組織中Shh表達(dá)下降,但其下降的原因還未可知,由于糖尿病病程中氧化應(yīng)激發(fā)揮作用已經(jīng)成為了一個不爭的事實,所以本課題主要探討氧化應(yīng)激是否能導(dǎo)致心肌細(xì)胞中Shh信號蛋白表達(dá)的降低。 方法: 選用原代培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細(xì)胞。用RT-PCR方法檢測心肌細(xì)胞內(nèi)Shh mRNA表達(dá)的變化;Western blot法檢測心肌細(xì)胞內(nèi)Shh蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果: 1.使用黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤(xo/x)濃度分別為xo (0.5u/L)/x(0.5mM)和xo(1u/L)/x(0.5mM)作用于心肌細(xì)胞24小時后,提取心肌細(xì)胞總RNA,檢測細(xì)胞內(nèi)Shh mRNA表達(dá)的變化。以管家基因GAPDH為內(nèi)參,與正常對照組相比,不同濃度的xo/x分別使心肌細(xì)胞內(nèi)Shh mRNA表達(dá)降低40.1%和59.2% (P0.05)。另外在氧化應(yīng)激的基礎(chǔ)上(xo(1u/L)/x(0.5mM))給予0.1mM和0.5mM抗氧化劑tempol共同孵育24小時,同樣檢測細(xì)胞內(nèi)Shh mRNA表達(dá)的變化。以管家基因GAPDH為內(nèi)參,與單純氧化應(yīng)激組相比,不同濃度的tempol分別使心肌細(xì)胞內(nèi)Shh mRNA表達(dá)上升7.4% (P0.05)和45.2% (P0.05)。 2.使用黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤(xo/x)濃度分別為xo (0.5u/L)/x(0.5mM)和xo(1u/L)/x(0.5mM)作用于心肌細(xì)胞24小時后,提取心肌細(xì)胞總蛋白,檢測細(xì)胞內(nèi)Shh蛋白表達(dá)的變化。以管家基因GAPDH蛋白為內(nèi)參,與正常組對照組相比,不同濃度的xo/x分別使心肌細(xì)胞內(nèi)Shh蛋白表達(dá)降低19%和38.6% (P0.05)。另外在氧化應(yīng)激的基礎(chǔ)上(xo(1u/L)/x(0.5mM))給予0.1mM和0.5mM抗氧化劑tempol共同孵育24小時,同樣檢測細(xì)胞內(nèi)Shh蛋白表達(dá)的變化。以管家基因GAPDH蛋白為內(nèi)參,與單純氧化應(yīng)激組相比,不同濃度的tempol分別使心肌細(xì)胞內(nèi)Shh蛋白表達(dá)上升0.08% (P0.05)和24.4% (P0.05)。 結(jié)論: 氧化應(yīng)激系統(tǒng)(黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤)刺激心肌細(xì)胞,導(dǎo)致Shh mRNA和蛋白表達(dá)降低,用tempol抗氧化保護(hù)可以抑制氧化應(yīng)激系統(tǒng)造成的Shh mRNA和蛋白表達(dá)降低。由此可見,氧化應(yīng)激直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞中Shh表達(dá)下降。 第二部分小鼠急性心肌梗塞模型的制備 目的: 大量臨床研究表明,糖尿病與心力衰竭之間有著獨(dú)立密切的聯(lián)系,不僅表現(xiàn)在糖尿病患者同時患心力衰竭的機(jī)率遠(yuǎn)大于非糖尿病患者,還表現(xiàn)在糖尿病患者同時患上心肌梗塞后,其修復(fù)速度遠(yuǎn)小于非糖尿病患者。已有研究表明,在小鼠急性心梗模型中Shh的表達(dá)是增加的,且Shh對急、慢性心肌缺血模型以及缺血再灌注損傷模型有顯著的修復(fù)治療作用。我們之前的研究已經(jīng)證實,糖尿病小鼠心肌組織中Shh表達(dá)降低,因此,建立小鼠急性心肌梗塞模型可以進(jìn)一步研究糖尿病小鼠心肌組織中Shh表達(dá)降低的意義。 方法: 結(jié)扎冠狀動脈左前降支制造小鼠急性心肌梗塞模型。心肌梗塞兩周后,通過形態(tài)學(xué)觀察、檢測左室收縮末內(nèi)徑(LVED;s)、左室舒張末內(nèi)徑(LVED;d)、左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS%)、射血分?jǐn)?shù)(EF%)、左室收縮期前壁厚度(LVAW;s)、后壁厚度(LVPW;s),左室舒張期前壁厚度(LVAW;d)、后壁厚度(LVPW;d)來確認(rèn)心肌梗塞模型的成功。 結(jié)果: 1.形態(tài)學(xué)觀察:將正常組兩周和心梗組兩周的心臟取出,經(jīng)過處理取像后觀察左室前壁厚度、顏色和心室腔大小,結(jié)果顯示心梗組兩周的左室前壁變薄、顏色變白,且室腔擴(kuò)大明顯。 2.超聲心功能評價:應(yīng)用實時超聲成像系統(tǒng)Vevo770 (Visualsonics)于術(shù)前及術(shù)后兩周行經(jīng)胸超聲檢查。結(jié)果顯示心梗組兩周的左室前壁明顯變薄,且心室腔明顯擴(kuò)大。心梗組兩周的左室收縮期和舒張期前壁厚度(LVAW;s、LVAW;d)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF%)、左心室短軸縮短率( FS%)、心輸出量(CO)分別比正常組兩周時低70%、53.8%、65.15%、71.08%、47.12% (P0.05),左心室收縮末期內(nèi)徑(LVID;s)、舒張末期內(nèi)徑(LVID;d)分別比正常組兩周時高67.5%、15.6%(P0.05);心梗組術(shù)前與正常組術(shù)前上述各指標(biāo)比較沒有明顯變化(P0.05)。 結(jié)論: 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和超聲評價指標(biāo)均顯示按照本實驗室條件以及方法確實能有效的形成急性心肌梗塞模型。這為今后繼續(xù)深入探討Shh在糖尿病心肌組織中表達(dá)降低的意義打下了良好的基礎(chǔ)。
[Abstract]:The effect of Part 1 oxidative stress on the expression of Sonic hedgehog (Shh) in neonatal rat cardiac myocytes
Objective:
Hedgehog瀹舵棌鏄竴綾誨垎娉屼俊鍙瘋泲鐧，

本文編號：1613086