本文選題：間充質(zhì)干細胞　切入點：轉(zhuǎn)化　出處：《暨南大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：實施成體干細胞治療的關(guān)鍵之一是獲得足夠數(shù)量的細胞數(shù),及有效向功能細胞終末分化的誘導(dǎo)。最近研究發(fā)現(xiàn)：骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)擴增時可能出現(xiàn)不正常的轉(zhuǎn)化細胞群,因此,通過體外培養(yǎng)對成體干細胞進行擴增,從而獲得足夠用于干細胞治療細胞數(shù)這一常規(guī)策略的安全性愈來愈被人們所關(guān)注。 前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)：對大鼠源性的骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)及傳代擴增時,會產(chǎn)生呈圓形、克隆樣生長且可形成類胚體樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化細胞群,應(yīng)用貼壁分離法、分步胰蛋白酶消化法和有限稀釋法組合方法,我們已經(jīng)將該轉(zhuǎn)化細胞群分離。對該轉(zhuǎn)化細胞群研究發(fā)現(xiàn)：該細胞群具有高增殖能力(可穩(wěn)定傳代至220代)且體外經(jīng)5-氮胞苷(5-Aza,一種DNA轉(zhuǎn)甲基酶抑制劑)處理后具有心肌分化潛能。該細胞群不表達間充質(zhì)干細胞表面標志物：CD90；不表達造血干細胞表面標志物：CD34和CD45；內(nèi)皮祖細胞標志物：CD31, flk-1及T細胞標志物：CD4。經(jīng)長期傳代處理后該細胞群的表型、倍增時間、細胞周期分布及心肌分化潛能都未有顯著變化,復(fù)制性衰老不明顯。 在本博士學(xué)位論文中,在上述基礎(chǔ)上對該經(jīng)分離的轉(zhuǎn)化細胞群的如下問題進行研究：(1)形成情況的統(tǒng)計分析；(2)超微結(jié)構(gòu)；(3)特異性標志物；(4)生長特性；(5)time-lapse研究;(6)核轉(zhuǎn)染及標記示蹤；(7)基因表達譜研究；(8)Oct4(干細胞多能性轉(zhuǎn)錄因子之一)基因沉默對其增殖的影響；(9)端粒酶活性檢測；(10)核型分析；(11)體內(nèi)成瘤性分析。 本博士學(xué)位論文對上述問題進行研究并發(fā)現(xiàn)：使用DMEM培養(yǎng)基對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)時未見該轉(zhuǎn)化細胞群,使用IMDM培養(yǎng)基分別對10只成年SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)有6只出現(xiàn)了該轉(zhuǎn)化細胞群,其中2只原代培養(yǎng)時出現(xiàn)、1只第3代時出現(xiàn)、1只第4代時出現(xiàn)、2只第5代時出現(xiàn)。使用IMDM培養(yǎng)基分別對4只老年SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)有3只出現(xiàn)了該轉(zhuǎn)化細胞群,其中2只原代培養(yǎng)時出現(xiàn)、1只第4代時出現(xiàn)。應(yīng)用掃描電鏡及透射電鏡對經(jīng)分離的代表性細胞群(E1單細胞克隆)超微結(jié)構(gòu)進行分析,發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化細胞群直徑為6-9μm,具有較高的核質(zhì)比且富含線粒體,細胞質(zhì)中含少量顆粒。應(yīng)用基因表達芯片結(jié)合實時定量PCR技術(shù)對該細胞群的表面標志物進行進一步鑒別,發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化細胞群間充質(zhì)干細胞代表性表面標志物CD73呈陽性而CD105呈陰性；B細胞標志物CD19呈陰性,同時還表達一些自身特有的標志物：CD9、CD24、CD63、CD68、CD81、CD276和CD302均呈陽性。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)該細胞群接觸抑制不明顯,既可貼壁生長,當長滿后,細胞可立體向上突起立體生長,懸浮的該細胞再培養(yǎng)也可再貼壁生長。應(yīng)用活細胞time-lapse技術(shù)對該細胞群進行觀察也證明上述生長特性,同時也發(fā)現(xiàn)該細胞群大約需要6-7小時分裂一次。經(jīng)Fast-Dil標記該轉(zhuǎn)化細胞群E1單細胞克隆細胞與經(jīng)培養(yǎng)2天新生大鼠心肌細胞共培養(yǎng)3天后,呈紅色熒光的該轉(zhuǎn)化細胞群可表達心肌特異性標志物心肌肌鈣蛋白Ⅰ；同時,對該細胞群體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)：往行冠狀動脈前降支結(jié)扎模型大鼠的尾靜脈注射經(jīng)Fast-Dil標記該細胞群,7天后在缺血心肌中發(fā)現(xiàn)呈紅色熒光的經(jīng)注射細胞團,并表達心肌特異性標志物心肌型肌鈣蛋白Ⅰ,提示：該細胞群具有體內(nèi)心肌靶向潛能,并有向心肌分化的潛能。使用基因芯片對該細胞群(E1單細胞克隆)經(jīng)5-Aza處理前后差異基因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在26,419個檢測基因中,663個基因顯著受5-Aza調(diào)控(倍變2),其中118個基因上調(diào)2倍,545個基因下調(diào)2倍。GO分析工具MAS2.0按分子功能和生物學(xué)過程將差異基因分類�；贛AS2.0的分析結(jié)果,5-Aza處理后下調(diào)大于2倍基因若按Molecular Function分類,主要富集在rRNA binding、RNA binding、mRNA binding(前3個且p0.05)；若按Biological Process分類,主要富集在complement activation, classical pathway、negative regulation of RNA splicing、hydrogen peroxide biosynthesis(前3個且p0.05)；上調(diào)大于2倍基因若按Molecular Function分類,主要富集在calcium ion binding、L-lysine transporter actiy、dimethyladenosine transferase activity (前3個且p0.05)；若按Biological Process分類,主要富集在cell adhesion、smoothened signaling pathway involved in spinal cord motor neuron cell fate specification lysine transport(前3個且p0.05)。應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫分析受5-Aza調(diào)控通路,發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因參與通路有(前3個且p0.05)：ECM-receptor interaction通路、Glycosphingolipid biosynthesis-ganglioseries通路和Chondroitin sulfate biosynthesis通路,下調(diào)基因參與的通路有(前3個且p0.05)：Complement and coagulation cascades通路、Oxidative phosphorylation通路和Alzheimer's disease通路。應(yīng)用TRAP-銀染法對該細胞群端粒酶活性進行檢測發(fā)現(xiàn)第70代及第212代具有端粒酶活性,且第212代較第70代的活性水平高。應(yīng)用核轉(zhuǎn)染技術(shù)對該細胞群進行GFP(綠色熒光蛋白)基因轉(zhuǎn)染標記并進行體內(nèi)示蹤研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞能保持其細胞形態(tài)、增殖及分化潛能,轉(zhuǎn)染效率受代數(shù)影響不明顯,經(jīng)心肌內(nèi)注射經(jīng)標記細胞在體內(nèi)可維持表達GFP約1周。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)：不同代數(shù)該細胞群穩(wěn)定表達Oct4,隨后應(yīng)用RNAi技術(shù)對該細胞群中Oct4基因進行沉默,48小時后發(fā)現(xiàn)該細胞形態(tài)從小圓形變?yōu)榇蟊馄綐?生長變得極為緩慢。應(yīng)用染色體G顯帶技術(shù)對該細胞群經(jīng)有限稀釋篩選后的四個不同單細胞克隆D6、E1、G11和H7進行染色體核型分析,發(fā)現(xiàn)該細胞群染色體數(shù)日異常,D6單細胞克隆59.3%為39條染色體、E1單細胞克隆70.5%為39條染色體、G11單細胞克隆60.7%為39條染色體,H7單細胞克隆68.0%為39條染色體,其中以缺失第19、20號染色體為主(D6單細胞克隆24.6%缺失19號,37.7%缺失20號；E1單細胞克隆30.5%缺失19號,38.9%缺失20號；G11單細胞克隆23.7%缺失19號,40.6%缺失20號；H7單細胞克隆28.8%缺失19號,32.2%缺失20號)。將該細胞群(E1單細胞克隆)通過皮下注射及尾靜脈注射移植至裸鼠體內(nèi)60天進行成瘤性實驗,未發(fā)現(xiàn)形成腫瘤。本學(xué)位論文研究提示常規(guī)的體外擴增大鼠間充質(zhì)干細胞可引起永生化及不致瘤性的自發(fā)轉(zhuǎn)化,該細胞群既具有類干細胞特性,具有高增殖能力、可形成類胚體且具有體內(nèi)外向心肌分化潛能,也具有類腫瘤細胞特性,接觸抑制不明顯、可立體生長及染色體異常。該細胞群可能是一種介于間充質(zhì)干細胞和腫瘤細胞之間的過度狀態(tài)的細胞群,可作為新的細胞類型進行深入研究,深入對該類細胞的特性研究,可能有助于對成體干細胞及腫瘤干細胞的認識,同時也十分有助于研發(fā)安全可靠的成體干細胞療法,本研究也提示：使用體外培養(yǎng)擴增成體干細胞去實施干細胞治療時,應(yīng)在確保細胞的正常性的前提下,才能進入臨床研究。
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【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【引證文獻】

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本文編號：1608392