本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：轉(zhuǎn)化　出處：《暨南大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：實(shí)施成體干細(xì)胞治療的關(guān)鍵之一是獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞數(shù),及有效向功能細(xì)胞終末分化的誘導(dǎo)。最近研究發(fā)現(xiàn)：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增時(shí)可能出現(xiàn)不正常的轉(zhuǎn)化細(xì)胞群,因此,通過(guò)體外培養(yǎng)對(duì)成體干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,從而獲得足夠用于干細(xì)胞治療細(xì)胞數(shù)這一常規(guī)策略的安全性愈來(lái)愈被人們所關(guān)注。 前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)：對(duì)大鼠源性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)及傳代擴(kuò)增時(shí),會(huì)產(chǎn)生呈圓形、克隆樣生長(zhǎng)且可形成類胚體樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞群,應(yīng)用貼壁分離法、分步胰蛋白酶消化法和有限稀釋法組合方法,我們已經(jīng)將該轉(zhuǎn)化細(xì)胞群分離。對(duì)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞群研究發(fā)現(xiàn)：該細(xì)胞群具有高增殖能力(可穩(wěn)定傳代至220代)且體外經(jīng)5-氮胞苷(5-Aza,一種DNA轉(zhuǎn)甲基酶抑制劑)處理后具有心肌分化潛能。該細(xì)胞群不表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物：CD90；不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物：CD34和CD45；內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志物：CD31, flk-1及T細(xì)胞標(biāo)志物：CD4。經(jīng)長(zhǎng)期傳代處理后該細(xì)胞群的表型、倍增時(shí)間、細(xì)胞周期分布及心肌分化潛能都未有顯著變化,復(fù)制性衰老不明顯。 在本博士學(xué)位論文中,在上述基礎(chǔ)上對(duì)該經(jīng)分離的轉(zhuǎn)化細(xì)胞群的如下問(wèn)題進(jìn)行研究：(1)形成情況的統(tǒng)計(jì)分析；(2)超微結(jié)構(gòu)；(3)特異性標(biāo)志物；(4)生長(zhǎng)特性；(5)time-lapse研究;(6)核轉(zhuǎn)染及標(biāo)記示蹤；(7)基因表達(dá)譜研究；(8)Oct4(干細(xì)胞多能性轉(zhuǎn)錄因子之一)基因沉默對(duì)其增殖的影響；(9)端粒酶活性檢測(cè)；(10)核型分析；(11)體內(nèi)成瘤性分析。 本博士學(xué)位論文對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行研究并發(fā)現(xiàn)：使用DMEM培養(yǎng)基對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)未見(jiàn)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞群,使用IMDM培養(yǎng)基分別對(duì)10只成年SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)有6只出現(xiàn)了該轉(zhuǎn)化細(xì)胞群,其中2只原代培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)、1只第3代時(shí)出現(xiàn)、1只第4代時(shí)出現(xiàn)、2只第5代時(shí)出現(xiàn)。使用IMDM培養(yǎng)基分別對(duì)4只老年SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)有3只出現(xiàn)了該轉(zhuǎn)化細(xì)胞群,其中2只原代培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)、1只第4代時(shí)出現(xiàn)。應(yīng)用掃描電鏡及透射電鏡對(duì)經(jīng)分離的代表性細(xì)胞群(E1單細(xì)胞克隆)超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞群直徑為6-9μm,具有較高的核質(zhì)比且富含線粒體,細(xì)胞質(zhì)中含少量顆粒。應(yīng)用基因表達(dá)芯片結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)該細(xì)胞群的表面標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步鑒別,發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞群間充質(zhì)干細(xì)胞代表性表面標(biāo)志物CD73呈陽(yáng)性而CD105呈陰性；B細(xì)胞標(biāo)志物CD19呈陰性,同時(shí)還表達(dá)一些自身特有的標(biāo)志物：CD9、CD24、CD63、CD68、CD81、CD276和CD302均呈陽(yáng)性。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞群接觸抑制不明顯,既可貼壁生長(zhǎng),當(dāng)長(zhǎng)滿后,細(xì)胞可立體向上突起立體生長(zhǎng),懸浮的該細(xì)胞再培養(yǎng)也可再貼壁生長(zhǎng)。應(yīng)用活細(xì)胞time-lapse技術(shù)對(duì)該細(xì)胞群進(jìn)行觀察也證明上述生長(zhǎng)特性,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞群大約需要6-7小時(shí)分裂一次。經(jīng)Fast-Dil標(biāo)記該轉(zhuǎn)化細(xì)胞群E1單細(xì)胞克隆細(xì)胞與經(jīng)培養(yǎng)2天新生大鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)3天后,呈紅色熒光的該轉(zhuǎn)化細(xì)胞群可表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物心肌肌鈣蛋白Ⅰ；同時(shí),對(duì)該細(xì)胞群體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)：往行冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎模型大鼠的尾靜脈注射經(jīng)Fast-Dil標(biāo)記該細(xì)胞群,7天后在缺血心肌中發(fā)現(xiàn)呈紅色熒光的經(jīng)注射細(xì)胞團(tuán),并表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物心肌型肌鈣蛋白Ⅰ,提示：該細(xì)胞群具有體內(nèi)心肌靶向潛能,并有向心肌分化的潛能。使用基因芯片對(duì)該細(xì)胞群(E1單細(xì)胞克隆)經(jīng)5-Aza處理前后差異基因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在26,419個(gè)檢測(cè)基因中,663個(gè)基因顯著受5-Aza調(diào)控(倍變2),其中118個(gè)基因上調(diào)2倍,545個(gè)基因下調(diào)2倍。GO分析工具M(jìn)AS2.0按分子功能和生物學(xué)過(guò)程將差異基因分類�；贛AS2.0的分析結(jié)果,5-Aza處理后下調(diào)大于2倍基因若按Molecular Function分類,主要富集在rRNA binding、RNA binding、mRNA binding(前3個(gè)且p0.05)；若按Biological Process分類,主要富集在complement activation, classical pathway、negative regulation of RNA splicing、hydrogen peroxide biosynthesis(前3個(gè)且p0.05)；上調(diào)大于2倍基因若按Molecular Function分類,主要富集在calcium ion binding、L-lysine transporter actiy、dimethyladenosine transferase activity (前3個(gè)且p0.05)；若按Biological Process分類,主要富集在cell adhesion、smoothened signaling pathway involved in spinal cord motor neuron cell fate specification lysine transport(前3個(gè)且p0.05)。應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析受5-Aza調(diào)控通路,發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因參與通路有(前3個(gè)且p0.05)：ECM-receptor interaction通路、Glycosphingolipid biosynthesis-ganglioseries通路和Chondroitin sulfate biosynthesis通路,下調(diào)基因參與的通路有(前3個(gè)且p0.05)：Complement and coagulation cascades通路、Oxidative phosphorylation通路和Alzheimer's disease通路。應(yīng)用TRAP-銀染法對(duì)該細(xì)胞群端粒酶活性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)第70代及第212代具有端粒酶活性,且第212代較第70代的活性水平高。應(yīng)用核轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)該細(xì)胞群進(jìn)行GFP(綠色熒光蛋白)基因轉(zhuǎn)染標(biāo)記并進(jìn)行體內(nèi)示蹤研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞能保持其細(xì)胞形態(tài)、增殖及分化潛能,轉(zhuǎn)染效率受代數(shù)影響不明顯,經(jīng)心肌內(nèi)注射經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞在體內(nèi)可維持表達(dá)GFP約1周。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：不同代數(shù)該細(xì)胞群穩(wěn)定表達(dá)Oct4,隨后應(yīng)用RNAi技術(shù)對(duì)該細(xì)胞群中Oct4基因進(jìn)行沉默,48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞形態(tài)從小圓形變?yōu)榇蟊馄綐?生長(zhǎng)變得極為緩慢。應(yīng)用染色體G顯帶技術(shù)對(duì)該細(xì)胞群經(jīng)有限稀釋篩選后的四個(gè)不同單細(xì)胞克隆D6、E1、G11和H7進(jìn)行染色體核型分析,發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞群染色體數(shù)日異常,D6單細(xì)胞克隆59.3%為39條染色體、E1單細(xì)胞克隆70.5%為39條染色體、G11單細(xì)胞克隆60.7%為39條染色體,H7單細(xì)胞克隆68.0%為39條染色體,其中以缺失第19、20號(hào)染色體為主(D6單細(xì)胞克隆24.6%缺失19號(hào),37.7%缺失20號(hào)；E1單細(xì)胞克隆30.5%缺失19號(hào),38.9%缺失20號(hào)；G11單細(xì)胞克隆23.7%缺失19號(hào),40.6%缺失20號(hào)；H7單細(xì)胞克隆28.8%缺失19號(hào),32.2%缺失20號(hào))。將該細(xì)胞群(E1單細(xì)胞克隆)通過(guò)皮下注射及尾靜脈注射移植至裸鼠體內(nèi)60天進(jìn)行成瘤性實(shí)驗(yàn),未發(fā)現(xiàn)形成腫瘤。本學(xué)位論文研究提示常規(guī)的體外擴(kuò)增大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞可引起永生化及不致瘤性的自發(fā)轉(zhuǎn)化,該細(xì)胞群既具有類干細(xì)胞特性,具有高增殖能力、可形成類胚體且具有體內(nèi)外向心肌分化潛能,也具有類腫瘤細(xì)胞特性,接觸抑制不明顯、可立體生長(zhǎng)及染色體異常。該細(xì)胞群可能是一種介于間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的過(guò)度狀態(tài)的細(xì)胞群,可作為新的細(xì)胞類型進(jìn)行深入研究,深入對(duì)該類細(xì)胞的特性研究,可能有助于對(duì)成體干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞的認(rèn)識(shí),同時(shí)也十分有助于研發(fā)安全可靠的成體干細(xì)胞療法,本研究也提示：使用體外培養(yǎng)擴(kuò)增成體干細(xì)胞去實(shí)施干細(xì)胞治療時(shí),應(yīng)在確保細(xì)胞的正常性的前提下,才能進(jìn)入臨床研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1608392