發(fā)布時(shí)間：2018-03-11 19:11

  本文選題：Galectin-9　切入點(diǎn)：脂多糖　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 近幾十年來,人們對蛋白和基因的研究有很大的突破,但是對于早期發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于細(xì)胞表面且表達(dá)各異的糖綴合物卻知之不多。Galectin(半乳糖凝集素)是細(xì)胞質(zhì)蛋白,廣泛地分布于細(xì)胞內(nèi)外,可以靶向分泌到細(xì)胞核內(nèi)或在胞漿中,與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的蛋白相互作用,傳導(dǎo)細(xì)胞信號,調(diào)節(jié)mRNA的剪切、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞的凋亡�；蛘咄ㄟ^非經(jīng)典途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體復(fù)合物,釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中,連接細(xì)胞外基質(zhì)中包含β-半乳糖苷的糖綴合物和細(xì)胞表面的黏附因子,調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和分化。至今已經(jīng)成功克隆了15個(gè)家族成員,Galectin-1及Galectin-3等已研究得較為深入。 Galectin-9是半乳糖結(jié)合蛋白家族的成員之一,屬于動(dòng)物凝集素,能夠與細(xì)胞表面和細(xì)胞間質(zhì)中的半乳糖特異性的結(jié)合,發(fā)揮細(xì)胞之間以及細(xì)胞與間質(zhì)之間的信號傳遞作用。Galectin-9結(jié)構(gòu)上具有兩個(gè)羰基結(jié)合區(qū)域(CRD),分子量為36 kDa,中間由連接肽連接,具有比較明確的激活嗜紅細(xì)胞,分化單核細(xì)胞的作用。人類Galectin-9是在Hodgkin's病人的組織克隆出來的,并廣泛分布于人體。其生物活性主要介入細(xì)胞黏附,增殖,凋亡,細(xì)胞周期。在免疫反應(yīng)中,可以在T細(xì)胞浸潤的組織中不同的細(xì)胞上如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等檢測到。提示Galectin-9在調(diào)控免疫反應(yīng)中起重要作用。最新文獻(xiàn)提示Galectin-9在數(shù)種腫瘤中有抗轉(zhuǎn)移潛力,例如乳癌,鱗狀細(xì)胞癌。還有報(bào)道Galectin-9可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟。 T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白3(T cell immunoglobulin mucin 3,TIM3)是分化成熟Th1細(xì)胞表達(dá)的分子,而不表達(dá)在Th2細(xì)胞表面,現(xiàn)已證明Galectin-9作為其配體,此途徑已明確是Th1細(xì)胞免疫作用的重要調(diào)節(jié)因子,可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的凋亡。且以鼠重組Galectin-9結(jié)合TIM-3可顯著抑制同種異體移植排斥和延長同種異體皮膚移植的生存。 免疫抑制是通過免疫抑制劑對T、B淋巴細(xì)胞的活化、分化好增殖的抑制以及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)的負(fù)向調(diào)節(jié)發(fā)揮抑制免疫系統(tǒng)的作用。CD4~+CD25~+Tregs亞群具有免疫調(diào)節(jié)功能,是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的主要類型,于1995年首次由Sakaguchi等提出。CD4~+CD25~+Tregs的免疫學(xué)特點(diǎn)是免疫無反應(yīng)性和免疫抑制性,可以通過下調(diào)機(jī)體的免疫應(yīng)答維持對自身和非自身抗原的免疫耐受,CD4~+CD25~+Tregs數(shù)量低下和功能紊亂可導(dǎo)致多種自身免疫性疾病,另外,它們在某些嚴(yán)重的炎癥性疾病和下調(diào)腫瘤免疫應(yīng)答中也起重要作用。CD4~+CD25~+Tregs以細(xì)胞接觸依賴性方式抑制CD4~+和CD8 +T細(xì)胞。在無抗原呈遞細(xì)胞出現(xiàn)的情況下仍可發(fā)生抑制現(xiàn)象,說明細(xì)胞間接觸方式是在抑制T細(xì)胞與反應(yīng)T細(xì)胞間進(jìn)行的,CD4~+CD25~+Tregs通過它們的TCR活化成為抑制性效應(yīng)T細(xì)胞,細(xì)胞一旦激活,其抑制功能是非特異性的,可抑制CD4和CD8 T細(xì)胞的活性。CD4~+CD25~+Tregs還抑制自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞的功能。在人類也發(fā)現(xiàn)了Tregs參與免疫耐受的證據(jù),Tregs升高往往與移植器官功能良好、免疫耐受的出現(xiàn)等呈現(xiàn)正相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3基因參與Treg細(xì)胞的中樞性和外周性生成過程,并影響Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮。 Galectin-9是半乳糖凝集素之一,誘導(dǎo)嗜酸性細(xì)胞,腫瘤,及T細(xì)胞的凋亡,優(yōu)先誘導(dǎo)CD4~+T細(xì)胞凋亡,我們設(shè)想通過分析Galectin-9是否能在體能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化和增殖,負(fù)向調(diào)節(jié)發(fā)揮抑制免疫系統(tǒng)的作用,從而影響受體對移植物的免疫耐受的形成。因此本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建小鼠重組腺病毒載體pAdeasyTM- Galectin-9,經(jīng)PCR、酶切、測序鑒定及Westernblot檢測,結(jié)果顯示,攜帶小鼠Galectin-9基因的腺病毒載體構(gòu)建成功。經(jīng)過病毒的擴(kuò)增及滴度檢測,我們構(gòu)建的小鼠pAdeasyTM- Galectin-9腺病毒獲得了較高的滴度。通過將外源性重組Galectin-9輸入小鼠心臟移植模型體內(nèi)觀察對移植物生存的影響,并且觀察Treg細(xì)胞的分化,增殖,探討Galectin-9可能誘導(dǎo)免疫耐受的作用提供新的思路。 第一部分Galectin-9腺病毒載體的構(gòu)建 腺病毒載體因其具有基因組結(jié)構(gòu)簡單、宿主細(xì)胞范圍廣、滴度高、感染效率高、無插入突變危險(xiǎn)等優(yōu)勢,因此我們選擇了AdEasy? Adenoviral Vector System體系構(gòu)建Galectin-9載體。首先取經(jīng)過LPS刺激4小時(shí)后的小鼠脾臟,抽提其mRNA,然后根據(jù)報(bào)道及Genebank發(fā)布的基因和蛋白序列,設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物,RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增獲得小鼠Galectin-9全長基因序列,雙酶切后連接到AdEasy? Adenoviral Vector System體系中的pShuttle-CMV中,然后與pAdeasy-1同源重組,在293A細(xì)胞中包裝出帶有Galectin-9目的基因的腺病毒pAdeasy- Galectin-9。通過PCR、酶切、測序鑒定及Westernblot檢測,結(jié)果顯示,攜帶小鼠Galectin-9基因的腺病毒載體可高表達(dá)Galectin-9蛋白,說明帶有目的基因Galectin-9的腺病毒構(gòu)建成功。經(jīng)過病毒的擴(kuò)增及滴度檢測,我們構(gòu)建的小鼠pAdeasy- Galectin-9腺病毒獲得了較高的滴度。 第二部分重組Galectin-9腺病毒對小鼠心臟移植模型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖的影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的:通過觀察重組Galectin-9腺病毒、空病毒及對照組生理鹽水對小鼠異位心臟移植術(shù)后移植心臟生存時(shí)間、脾臟CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞增殖情況和Foxp3的表達(dá)的影響,探討Galectin-9誘導(dǎo)免疫耐受的可能性及其機(jī)制。方法:應(yīng)用Cuff法建立雄性BALB/C→C57BL/10小鼠頸部異位心臟移植模型,根據(jù)術(shù)后用藥情況,受體分為3組(n=10);對照組(術(shù)后用生理鹽水)、空病毒組、重組Galectin-9腺病毒治療組。記錄移植心臟生存時(shí)間,于移植心停搏或術(shù)后14d取脾,分離單個(gè)核細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞。半定量RT-PCR檢測Foxp3mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:與對照組比較,重組Galectin-9腺病毒組明顯提高移植心臟的生存時(shí)間(p0.01),空病毒組在延長生存時(shí)間方面與對照組比較無明顯差異(p0.05);與對照組比較,重組Galectin-9腺病毒組CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞占CD4~+ T細(xì)胞比例明顯升高(12.20% vs 7.35%,p0.01),空病毒組CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞占CD4~+ T細(xì)胞比例無明顯差異(6.90% vs 7.35%, p0.05);重組Galectin-9腺病毒組T細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P0.01);空病毒組T細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)與對照組比較無明顯差異(p0.05)。結(jié)論:小鼠心臟移植后使用重組腺病毒Galectin-9明顯提高了移植心臟的生存期,小鼠心臟移植后使用空病毒與對照組生理鹽水比較對提高移植心臟的生存期無明顯影響,重組腺病毒Galectin-9體內(nèi)促進(jìn)CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞的增殖與生長;而空病毒在體內(nèi)對CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞的增殖與生長無明顯影響;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)Foxp3與CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞呈正相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1599512