本文選題：Galectin-9　切入點：脂多糖　出處：《第二軍醫(yī)大學》2009年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 近幾十年來,人們對蛋白和基因的研究有很大的突破,但是對于早期發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于細胞表面且表達各異的糖綴合物卻知之不多。Galectin(半乳糖凝集素)是細胞質蛋白,廣泛地分布于細胞內外,可以靶向分泌到細胞核內或在胞漿中,與細胞質和細胞核中的蛋白相互作用,傳導細胞信號,調節(jié)mRNA的剪切、細胞周期、細胞增殖和細胞的凋亡�；蛘咄ㄟ^非經典途徑和內質網高爾基體復合物,釋放到細胞外基質中,連接細胞外基質中包含β-半乳糖苷的糖綴合物和細胞表面的黏附因子,調節(jié)細胞的黏附和分化。至今已經成功克隆了15個家族成員,Galectin-1及Galectin-3等已研究得較為深入。 Galectin-9是半乳糖結合蛋白家族的成員之一,屬于動物凝集素,能夠與細胞表面和細胞間質中的半乳糖特異性的結合,發(fā)揮細胞之間以及細胞與間質之間的信號傳遞作用。Galectin-9結構上具有兩個羰基結合區(qū)域(CRD),分子量為36 kDa,中間由連接肽連接,具有比較明確的激活嗜紅細胞,分化單核細胞的作用。人類Galectin-9是在Hodgkin's病人的組織克隆出來的,并廣泛分布于人體。其生物活性主要介入細胞黏附,增殖,凋亡,細胞周期。在免疫反應中,可以在T細胞浸潤的組織中不同的細胞上如內皮細胞、成纖維細胞、肺上皮細胞和心肌細胞等檢測到。提示Galectin-9在調控免疫反應中起重要作用。最新文獻提示Galectin-9在數(shù)種腫瘤中有抗轉移潛力,例如乳癌,鱗狀細胞癌。還有報道Galectin-9可誘導樹突狀細胞成熟。 T細胞免疫球蛋白粘蛋白3(T cell immunoglobulin mucin 3,TIM3)是分化成熟Th1細胞表達的分子,而不表達在Th2細胞表面,現(xiàn)已證明Galectin-9作為其配體,此途徑已明確是Th1細胞免疫作用的重要調節(jié)因子,可誘導Th1細胞的凋亡。且以鼠重組Galectin-9結合TIM-3可顯著抑制同種異體移植排斥和延長同種異體皮膚移植的生存。 免疫抑制是通過免疫抑制劑對T、B淋巴細胞的活化、分化好增殖的抑制以及誘導調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Tregs)的負向調節(jié)發(fā)揮抑制免疫系統(tǒng)的作用。CD4~+CD25~+Tregs亞群具有免疫調節(jié)功能,是機體內調節(jié)性T細胞的主要類型,于1995年首次由Sakaguchi等提出。CD4~+CD25~+Tregs的免疫學特點是免疫無反應性和免疫抑制性,可以通過下調機體的免疫應答維持對自身和非自身抗原的免疫耐受,CD4~+CD25~+Tregs數(shù)量低下和功能紊亂可導致多種自身免疫性疾病,另外,它們在某些嚴重的炎癥性疾病和下調腫瘤免疫應答中也起重要作用。CD4~+CD25~+Tregs以細胞接觸依賴性方式抑制CD4~+和CD8 +T細胞。在無抗原呈遞細胞出現(xiàn)的情況下仍可發(fā)生抑制現(xiàn)象,說明細胞間接觸方式是在抑制T細胞與反應T細胞間進行的,CD4~+CD25~+Tregs通過它們的TCR活化成為抑制性效應T細胞,細胞一旦激活,其抑制功能是非特異性的,可抑制CD4和CD8 T細胞的活性。CD4~+CD25~+Tregs還抑制自然殺傷細胞、B細胞以及其他免疫細胞的功能。在人類也發(fā)現(xiàn)了Tregs參與免疫耐受的證據,Tregs升高往往與移植器官功能良好、免疫耐受的出現(xiàn)等呈現(xiàn)正相關。轉錄因子Foxp3基因參與Treg細胞的中樞性和外周性生成過程,并影響Treg細胞免疫調節(jié)功能的發(fā)揮。 Galectin-9是半乳糖凝集素之一,誘導嗜酸性細胞,腫瘤,及T細胞的凋亡,優(yōu)先誘導CD4~+T細胞凋亡,我們設想通過分析Galectin-9是否能在體能誘導Treg細胞的分化和增殖,負向調節(jié)發(fā)揮抑制免疫系統(tǒng)的作用,從而影響受體對移植物的免疫耐受的形成。因此本實驗首先構建小鼠重組腺病毒載體pAdeasyTM- Galectin-9,經PCR、酶切、測序鑒定及Westernblot檢測,結果顯示,攜帶小鼠Galectin-9基因的腺病毒載體構建成功。經過病毒的擴增及滴度檢測,我們構建的小鼠pAdeasyTM- Galectin-9腺病毒獲得了較高的滴度。通過將外源性重組Galectin-9輸入小鼠心臟移植模型體內觀察對移植物生存的影響,并且觀察Treg細胞的分化,增殖,探討Galectin-9可能誘導免疫耐受的作用提供新的思路。 第一部分Galectin-9腺病毒載體的構建 腺病毒載體因其具有基因組結構簡單、宿主細胞范圍廣、滴度高、感染效率高、無插入突變危險等優(yōu)勢,因此我們選擇了AdEasy? Adenoviral Vector System體系構建Galectin-9載體。首先取經過LPS刺激4小時后的小鼠脾臟,抽提其mRNA,然后根據報道及Genebank發(fā)布的基因和蛋白序列,設計帶酶切位點的特異性引物,RNA逆轉錄PCR(RT-PCR)擴增獲得小鼠Galectin-9全長基因序列,雙酶切后連接到AdEasy? Adenoviral Vector System體系中的pShuttle-CMV中,然后與pAdeasy-1同源重組,在293A細胞中包裝出帶有Galectin-9目的基因的腺病毒pAdeasy- Galectin-9。通過PCR、酶切、測序鑒定及Westernblot檢測,結果顯示,攜帶小鼠Galectin-9基因的腺病毒載體可高表達Galectin-9蛋白,說明帶有目的基因Galectin-9的腺病毒構建成功。經過病毒的擴增及滴度檢測,我們構建的小鼠pAdeasy- Galectin-9腺病毒獲得了較高的滴度。 第二部分重組Galectin-9腺病毒對小鼠心臟移植模型調節(jié)性T細胞增殖的影響的實驗研究 目的:通過觀察重組Galectin-9腺病毒、空病毒及對照組生理鹽水對小鼠異位心臟移植術后移植心臟生存時間、脾臟CD4~+CD25~+Treg細胞增殖情況和Foxp3的表達的影響,探討Galectin-9誘導免疫耐受的可能性及其機制。方法:應用Cuff法建立雄性BALB/C→C57BL/10小鼠頸部異位心臟移植模型,根據術后用藥情況,受體分為3組(n=10);對照組(術后用生理鹽水)、空病毒組、重組Galectin-9腺病毒治療組。記錄移植心臟生存時間,于移植心停搏或術后14d取脾,分離單個核細胞,上流式細胞儀檢測CD4~+CD25~+Treg細胞。半定量RT-PCR檢測Foxp3mRNA表達水平。結果:與對照組比較,重組Galectin-9腺病毒組明顯提高移植心臟的生存時間(p0.01),空病毒組在延長生存時間方面與對照組比較無明顯差異(p0.05);與對照組比較,重組Galectin-9腺病毒組CD4~+CD25~+Treg細胞占CD4~+ T細胞比例明顯升高(12.20% vs 7.35%,p0.01),空病毒組CD4~+CD25~+Treg細胞占CD4~+ T細胞比例無明顯差異(6.90% vs 7.35%, p0.05);重組Galectin-9腺病毒組T細胞Foxp3 mRNA表達明顯高于對照組(P0.01);空病毒組T細胞Foxp3 mRNA表達與對照組比較無明顯差異(p0.05)。結論:小鼠心臟移植后使用重組腺病毒Galectin-9明顯提高了移植心臟的生存期,小鼠心臟移植后使用空病毒與對照組生理鹽水比較對提高移植心臟的生存期無明顯影響,重組腺病毒Galectin-9體內促進CD4~+CD25~+Treg細胞的增殖與生長;而空病毒在體內對CD4~+CD25~+Treg細胞的增殖與生長無明顯影響;體內實驗Foxp3與CD4~+CD25~+Treg細胞呈正相關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：1599512