本文選題：熒光探針　切入點(diǎn)：吖啶　出處：《山東師范大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 硫醇是生物體中許多蛋白質(zhì)和小分子的重要組成部分,在細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)中具有重要的作用。細(xì)胞內(nèi)硫醇的水平與白細(xì)胞缺失、牛皮癬、肝損傷、癌癥以及艾滋病等許多疾病有著直接的聯(lián)系。對細(xì)胞內(nèi)硫醇類物質(zhì)的檢測有助于闡明還原體系在整個(gè)細(xì)胞氧化還原網(wǎng)絡(luò)的重要調(diào)控作用。近年來,檢測細(xì)胞內(nèi)硫醇類物質(zhì)的研究越來越多,其中熒光法簡單易行,便于操作,具有高靈敏度、高選擇性和廣泛可用的熒光染料等特點(diǎn)。更加吸引人的是探針分子可以在不破壞生物活性的情況下進(jìn)入細(xì)胞,與活細(xì)胞內(nèi)的硫醇結(jié)合生成強(qiáng)熒光物質(zhì),并借助于激光共聚焦成像技術(shù),實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)硫醇的“可視化”,從而對它們在生命體內(nèi)進(jìn)行“實(shí)時(shí)在線”的檢測。 目前,用于檢測生物體內(nèi)硫醇的熒光探針發(fā)展迅速,然而能夠用于生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)快速檢測硫醇的熒光探針少有報(bào)道,因此我們的主要目的在于設(shè)計(jì)高選擇性、高靈敏度的,能夠快速檢測細(xì)胞內(nèi)硫醇的熒光探針。本論文基于熒光探針與硫醇類物質(zhì)特異性作用后熒光光譜性質(zhì)的改變從而實(shí)現(xiàn)對其的檢測。本文主要開展了以下兩方面的研究工作: (一)基于馬來酰亞胺基團(tuán)對巰基的特異性響應(yīng),以吖啶衍生物為母體設(shè)計(jì)合成了一種新的含有兩個(gè)馬來酰亞胺基團(tuán)、可以快速檢測非蛋白硫醇的熒光探針。探針本身熒光較弱,與非蛋白硫醇以1:2的比例反應(yīng)后熒光增強(qiáng)明顯,激發(fā)和發(fā)射波長分別位于380 nm和440 nm。由于探針分子中兩個(gè)馬來酰亞胺基團(tuán)是鄰位取代的,空間距離很近,當(dāng)探針與蛋白硫醇以1:1的比例反應(yīng)之后,受體積較大的蛋白硫醇影響,未反應(yīng)的馬來酰亞胺基團(tuán)空間位阻變大,很難繼續(xù)與其他蛋白硫醇反應(yīng),從而繼續(xù)猝滅母體熒光團(tuán)的熒光,導(dǎo)致探針熒光無法恢復(fù),因此探針對蛋白硫醇沒有響應(yīng);非蛋白硫醇由于體積較小,可以與探針分子以2:1的比例反應(yīng)而使探針熒光明顯增強(qiáng)。在室溫、生理pH值條件下探針能夠快速檢測非蛋白硫醇,1.5μM探針與1.0μM谷胱甘肽在小于1 min內(nèi)即反應(yīng)結(jié)束,蛋白硫醇、生物體內(nèi)的活性氧、金屬離子及其他抗氧化劑均對測定沒有干擾。在1.0×10~(-8)-1.5×10~(-6)M范圍內(nèi)谷胱甘肽的濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,方法的檢測限為7.7 nM。為了比較兩個(gè)馬來酰亞胺基團(tuán)之間的空間距離對反應(yīng)速率的影響,本文同時(shí)合成了間二馬來酰亞胺取代的化合物作為對比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)巰基響應(yīng)基團(tuán)處于間位時(shí)與非蛋白硫醇反應(yīng)速率比鄰位時(shí)速率慢很多,推測是由于鄰位取代時(shí)兩個(gè)取代基團(tuán)空間距離太近而存在空間位阻效應(yīng)(空間位阻效應(yīng)可以使反應(yīng)速率加快),使得探針本身能量較高而不如間位取代的化合物穩(wěn)定,從而更易與谷胱甘肽反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)探針溶液在室溫下放置三周后,溶液顏色由淺黃色變?yōu)辄S綠色(探針在冰箱中放置數(shù)月穩(wěn)定),而間位取代的化合物卻沒有任何變化,證明探針不如間位取代的化合物穩(wěn)定。 (二)以羅丹明110為母體設(shè)計(jì)合成一種含有兩個(gè)馬來酰胺基團(tuán)的化合物預(yù)期能夠快速檢測特異性小肽。
[Abstract]:Mercaptan is an important component of many proteins and small molecules in organisms, plays an important role in the antioxidant system in cells. Intracellular thiol levels and leukocyte deficiency, psoriasis, liver damage, cancer and AIDS many diseases is a direct link. The detection of intracellular thiols may help to elucidate restore the system restore an important role in the regulation network in the whole cell oxidation. In recent years, more and more research on detection of intracellular thiols, the fluorescence method is simple, easy to operate, with high sensitivity, high selectivity and wide availability of fluorescent dyes and other characteristics. More attractive is the probe molecules can enter the cell in the do not destroy the biological activity under the condition of thiols and in living cells are combined to generate a strong fluorescent material, and with the help of confocal laser imaging technology, intracellular thiols visibility And then they do "real-time online" detection in their lives.
At present, for the detection of biological thiols fluorescent probe developed rapidly, however, can be used under physiological conditions of fluorescent probe detection of thiols is rarely reported, so our main purpose is to design a high selectivity, high sensitivity, can rapid detection of intracellular thiol fluorescent probe. The fluorescence probe with thiols specificity after the change of fluorescence spectra to detect the based on. In this paper, the main work includes the following two aspects:
(a) maleimide group specificity of thiol responses based on a novel containing two maleimide groups were synthesized by acridine derivatives as matrix design, can rapid detection of non protein thiol fluorescent probe. The probe itself weak fluorescence, and non protein thiol to 1: ratio of 2 after the reaction of fluorescence enhanced obviously, excitation and emission wavelengths were 380 nm and 440 nm. for two maleimide groups in the ortho substituted probe molecule is, the space distance is very near, when the probe and protein thiol to the ratio of 1:1 reaction by larger protein thiols, unreacted maleimide groups steric change large, it is difficult to continue to react with other protein thiols, fluorescence quenching of fluorophores to continue maternal, leading to fluorescence cannot be recovered, so the probe did not respond to protein thiols; non protein thiol because of small volume, Can response to the ratio of 2:1 and the fluorescent probe molecules significantly enhanced. At room temperature, physiological pH conditions can quickly detect non protein thiol probe, 1.5 M and 1 M probe glutathione in less than 1 min in the end of the reaction, protein thiol, active oxygen in vivo, metal ions and other antioxidants no interference on the determination. In 1 * 10~ (-8) -1.5 * 10~ (-6) M in the range of glutathione concentration showed a good linear relationship with the fluorescence intensity, the detection limit was 7.7 nM. for comparison between the two maleimide group space distance effect on the reaction rate, at the same time, the synthesis of compounds the bismaleimide substituted for comparison, found that two sulfhydryl groups response reaction and non protein thiol in a rate much slower rate than ortho, presumably due to the two generation of the ortho substituted group The space is too close and steric effect (steric effect can accelerate the reaction rate), makes the probe itself with high energy and stable compounds substituted a better, thus more likely to react with glutathione. The experiment is allowed to stand for three weeks in the probe solution at room temperature, the solution color changed from pale yellow to yellow green (probe placed in the refrigerator for a few months, and stable) m-substituted compounds without any change, as a probe that stable compounds substituted.
(two) a compound containing two maleamide groups was designed and synthesized by Luo Danming 110 as the mother. It is expected to be able to quickly detect the specific peptide.

【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341;O657.3

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本文編號：1589504