發(fā)布時(shí)間：2018-03-09 11:51

  本文選題：臍帶血　切入點(diǎn)：內(nèi)皮祖細(xì)胞　出處：《中南大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 第一章活化TLR4對(duì)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響及機(jī)制研究 第一節(jié)人臍血兩種類型內(nèi)皮祖細(xì)胞體外分化研究 目的:研究人臍帶血中兩種類型內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外分化特征。 方法:采用6%羥乙基淀粉沉降法和密度梯度離心法聯(lián)合分離臍帶血中單個(gè)核細(xì)胞,在含有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)形態(tài)學(xué)、免疫熒光、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和流式細(xì)胞法分析細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)和生物學(xué)特征。 結(jié)果:貼壁細(xì)胞分為早期內(nèi)皮祖細(xì)胞和晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞兩種類型細(xì)胞。早期內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)從小的圓形細(xì)胞變成以集落為中心,周圍呈發(fā)芽式向外生長(zhǎng)的細(xì)胞群,晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞形成典型的“鋪路石樣”。DiL標(biāo)記的乙�；兔芏戎鞍�(DiL-acLDL)和FITC標(biāo)記荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)雙染色陽(yáng)性細(xì)胞初步鑒定為內(nèi)皮祖細(xì)胞。RT-PCR提示隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),內(nèi)皮特異性基因表達(dá)變化逐漸增強(qiáng),流式細(xì)胞分析提示早期EPC有AC133、CD34、KDR表達(dá);晚期EPCsAC133不表達(dá),CD34表達(dá)弱,KDR表達(dá)增強(qiáng)。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法提示早期EPCs增值能力弱,而晚期EPCs增值能力強(qiáng): 結(jié)論:在人臍血中可培養(yǎng)出兩種類型的EPCs,兩種細(xì)胞在細(xì)胞表型、內(nèi)皮特異性基因表達(dá)及細(xì)胞增殖能力方面存在明顯的差異。為進(jìn)一步研究EPCs提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二節(jié)活化TLR4誘導(dǎo)早期內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的機(jī)制研究 目的:研究Toll樣受體(TLRs)在臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞中的表達(dá)分析及脂多糖(LPS)對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響;分析活化的TLR4對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及機(jī)制分析。 方法:取體外培養(yǎng)的早期內(nèi)皮祖細(xì)胞,在貼壁細(xì)胞中加入不同濃度(1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml)的LPS,采用RT-PCR及流式細(xì)胞分析法檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞中TLRs及細(xì)胞因子的表達(dá);細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)量變化;Annexin V-PI檢測(cè)LPS作用下EPCs的凋亡情況;RT-PCR及流式細(xì)胞分析法檢測(cè)EPCs細(xì)胞表面標(biāo)記(AC133、CD34、KDR)的變化;Western blot檢測(cè)LPS作用下信號(hào)傳導(dǎo)通路中MAPK家族Erk、P38、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化情況。 結(jié)果: 1、RT-PCR結(jié)果顯示早期EPCs中表達(dá)除TLR7以外所有的TLRs,進(jìn)一步流式細(xì)胞分析證實(shí)EPCs表面表達(dá)CD14、TLR2和TLR4。在LPS刺激下EPCs表達(dá)IL—8、IFN-α、IFN-β、TNFα。 2、細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果顯示LPS(100ng/ml)作用下EPCs數(shù)量明顯增加(P＜0.01);Annexin V-PI染色分析發(fā)現(xiàn)LPS對(duì)EPCs的凋亡沒(méi)有影響。 3、RT-PCR及流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示EPCs細(xì)胞表面標(biāo)記AC133、CD34表達(dá)上調(diào),而KDR表達(dá)無(wú)明顯變化。 4、Western blot結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)TLR4信號(hào)傳導(dǎo)中MAPK家族中Erk、P38、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的磷酸活化。 結(jié)論: 1、發(fā)現(xiàn)早期內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)有生物學(xué)活性的TLRs,而TLR4在內(nèi)皮祖細(xì)胞中高表達(dá)。 2、活化的TLR4不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)。 3、內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)是LPS通過(guò)激活TLR4信號(hào)通路,最終激活NF-κB和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)所致。 第二章ADMA對(duì)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響及機(jī)制研究 第一節(jié)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞與ADMA在冠心病患者中的檢測(cè)及相關(guān)性分析 目的:探討冠心病患者中循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞與非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)的關(guān)系及臨床意義。 方法:50例冠心病患者均經(jīng)選擇性冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)有明顯的冠狀動(dòng)脈狹窄;30例對(duì)照組經(jīng)臨床檢查和選擇性冠狀動(dòng)脈造影排除冠心病。根據(jù)病變程度分組,測(cè)定各組患者血漿ADMA水平;采集研究對(duì)象外周血進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng),7—10天后倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成單位(CFU)評(píng)估循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞水平。 結(jié)果: 1、冠心病多支病變組血漿ADMA水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.01),Gensini積分≥60組血漿ADMA水平明顯高于對(duì)照組; 2、冠心病組中多支病變組循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞水平明顯低于對(duì)照組(P＜0.01);Gensini積分≥60組循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。血清ADMA與循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.416,P＜0.01)。 結(jié)論: 1、隨著冠心病病變程度的增加,體內(nèi)ADMA濃度逐漸增加,而EPCs逐漸減少,冠心病的發(fā)生和ADMA的蓄積和EPCs的減少相關(guān)。 2、體內(nèi)ADMA濃度和EPCs的數(shù)量呈負(fù)相關(guān),ADMA的增加可能導(dǎo)致循環(huán)EPCs數(shù)量的減少,ADMA通過(guò)何種機(jī)制影響體內(nèi)EPCs的數(shù)量,尚待進(jìn)一步研究。 第二節(jié)ADMA對(duì)人臍血早期內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖影響及L-精氨酸的作用 目的:研究非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)對(duì)人臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響,觀測(cè)L-精氨酸(L-arg)對(duì)ADMA的拮抗作用,并探討其機(jī)制。 方法:從臍帶血中分離出單個(gè)核細(xì)胞,體外培養(yǎng)7天,在貼壁細(xì)胞中加入不同濃度的非對(duì)稱性二甲基精氨酸(1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l)作用不同時(shí)間(24、48、72小時(shí)),用MTT比色實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成單位(CFU)計(jì)數(shù)的方法評(píng)價(jià)ADMA對(duì)EPCs增殖的影響;同時(shí),加入L-精氨酸后采用MTT比色實(shí)驗(yàn)和高倍熒光顯微鏡下DiI-acLDL染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析L-精氨酸對(duì)ADMA作用內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響;細(xì)胞隨機(jī)分5組:對(duì)照組,ADMA組,ADMA+L-精氨酸組,ADMA+吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)組,L-精氨酸組。運(yùn)用熒光染料檢測(cè)細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生。逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶亞基及細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑超氧化物歧化酶(MnSOD)mRNA變化。硝酸還原酶法測(cè)定培養(yǎng)液上清液一氧化氮(NO)的含量,采用化學(xué)比色法測(cè)定培養(yǎng)液上清液總一氧化氮合酶(NOS)活力。 結(jié)果: 1、ADMA呈量效和時(shí)效性的減少內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目和增殖能力,抑制NOS活性,降低NO水平: 2、隨著L-精氨酸濃度的增加,L-精氨酸能有效拮抗ADMA對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的抑制作用,同樣,L-精氨酸能通過(guò)拮抗ADMA,增強(qiáng)NOS活性,增加NO水平。 3、ADMA顯著增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成;L-精氨酸和抗氧化劑PDTC能抑制ADMA刺激后的細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生。 4、ADMA誘導(dǎo)NADPH氧化酶p22phox亞基、gp91phox亞基mRNA的表達(dá)明顯上調(diào),L-精氨酸和抗氧化劑(PDTC)能抑制這些基因的上調(diào)。 5、ADMA對(duì)抗氧化酶MnSOD mRNA表達(dá)沒(méi)有影響。 結(jié)論: 1、ADMA通過(guò)減少NO的生成,增加內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)活性氧生成,上調(diào)NADPH氧化酶表達(dá),抑制人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖,影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的內(nèi)皮再生功能。 2、外源性的L-精氨酸能拮抗ADMA對(duì)EPCs增殖的抑制作用,抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),起到保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用,從而保護(hù)內(nèi)皮功能。 3、ADMA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和抗氧化酶MnSOD無(wú)關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

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1 朱登納;賈延R，

本文編號(hào)：1588412