本文選題：晚期氧化蛋白產(chǎn)物　切入點(diǎn)：慢性腎衰　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)是Witko-Sarsat等于1996年首先報(bào)道的由尿毒癥血液透析(Hemodialysis,HD)患者血漿中分離出的含有雙酪氨酸結(jié)構(gòu)的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物,系因患者體內(nèi)過(guò)高的氧化應(yīng)激水平導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)氧化損傷所形成的終末產(chǎn)物的總稱�，F(xiàn)已明確,AOPPs是一類炎癥介質(zhì),能夠激活單核細(xì)胞,刺激TNF-α、IL-6、IL-1等炎性因子的合成釋放,促發(fā)單核細(xì)胞的炎癥效應(yīng),是HD患者免疫功能紊亂、加速性動(dòng)脈粥樣硬化、透析相關(guān)性淀粉樣變等長(zhǎng)期并發(fā)癥的重要致病環(huán)節(jié)。血漿中的AOPPs主要分為高分子量(約670kD)和低分子量(約70kD)兩種形式,高分子量AOPPs是氧化白蛋白的聚合體,在HD患者中起主要作用的是高分子量的AOPPs,在本文中我們主要研究高分子量AOPPs。AOPPs一旦形成即不可逆,因其分子量大,目前各種透析模式均不能有效清除,成為HD患者的長(zhǎng)期并發(fā)癥的重要致病因素,嚴(yán)重影響依賴性透析病人的長(zhǎng)期生存率和生存質(zhì)量。目前AOPPs的檢測(cè)主要是利用AOPPs在340nm波長(zhǎng)有紫外吸收峰,以在同一波長(zhǎng)有紫外吸收峰的氯胺-T作為替代品來(lái)定量檢測(cè),因氯胺T是一種有機(jī)化合物,并不能真實(shí)反映體內(nèi)的AOPPs水平,缺乏特異性,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。且該方法操作步驟煩瑣,需13000rpm離心1小時(shí),易受血脂、膽紅素、溶血、藥物的影響。近年的文獻(xiàn)報(bào)道,高速離心后HD患者血清AOPPs值明顯較未離心的AOPPs值低,且所測(cè)值與氧化應(yīng)激的另一指標(biāo)8-oxo-dG無(wú)關(guān)聯(lián),采用去脂劑沉淀甘油三酯后發(fā)現(xiàn),所測(cè)AOPPs值較未用去脂劑前下降51%,但無(wú)論是高速離心還是去脂劑沉淀甘油三酯后,HD患者體內(nèi)的AOPPs仍明顯高于正常,特異、準(zhǔn)確檢測(cè)血漿AOPPs顯得非常重要。 研究表明,AOPPs與疾病的嚴(yán)重程度和疾病的預(yù)后相關(guān)。因此,應(yīng)用AOPPs抗體通過(guò)免疫組化、ELISA、western blot等方法觀察AOPPs在病變組織或體液中的表達(dá)情況對(duì)相關(guān)疾病的診斷、療效觀察、預(yù)后等具有重要意義。AOPPs可通過(guò)沉積于血管、組織而加重動(dòng)脈粥樣硬化,透析相關(guān)性淀粉樣變,運(yùn)用其相應(yīng)抗體有可能阻斷AOPPs的作用,從而為AOPPs的毒性作用提供一種新的治療途徑。另外,借助抗體與抗原特異性結(jié)合的特性,也可以將AOPPs抗體偶聯(lián)透析器上,從而發(fā)揮靶向治療的作用。為進(jìn)一步研究AOPPs結(jié)合蛋白甚至受體奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。由上可見(jiàn),AOPPs抗體具有廣泛的應(yīng)用前景和潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前,國(guó)內(nèi)外仍無(wú)商品化的AOPPs抗體及這方面的研究報(bào)道。抗體制備中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是制備的抗原一定要純。目前國(guó)內(nèi)外主要采用人血白蛋白(human serum albumin,HSA)與次氯酸(HOCl)孵育體外制備AOPPs-HSA作為研究的對(duì)象,它具備與體內(nèi)AOPPs同樣的生物學(xué)活性,但是這樣制備出的AOPPs-HSA成分并不單一,能夠滿足生物學(xué)功能研究的要求,但卻不適合抗體制作。凝膠層析是以各種凝膠為固定相,利用流動(dòng)相中各組分的相對(duì)分子量不同而達(dá)到分離的一種層析方法。本文研究的重點(diǎn)是大分子量的AOPPs,Hitrap 26/60 sephacryl S-300 high Resolution是一種由分子量為4～20×104的葡聚糖交聯(lián)聚合而成的葡聚糖凝膠,適于大分子的分離,其分離范圍為10KD～1500KD�，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,AOPPs是一組不同分子量的復(fù)合物,為保證抗原的純度及篩選到的抗體具有特異性,我們?cè)诿庖邉?dòng)物時(shí)取AOPPs-HSA純化后的第一峰作為免疫原,制備AOPPs單克隆抗體,并以純化后第一峰作為篩選抗體的檢測(cè)源(以后在本文中免疫動(dòng)物、篩選抗體的檢測(cè)源、抗體特異性鑒定采用的AOPPs-HSA均為AOPPs-HSA純化后的第一峰)。 綜上所述,本研究的目的是采用HSA與HOCl孵育體外制備AOPPs,通過(guò)葡聚糖凝膠Hitrap 26/60 sephacryl S-300得到AOPPs的相對(duì)純品,取純化后的第一峰作為免疫原,并以純化后第一峰作為篩選抗體的檢測(cè)源,制備AOPPs的單克隆抗體,建立抗體工作平臺(tái),應(yīng)用AOPPs抗體通過(guò)Western blot、ELISA等方法觀察AOPPs在病變組織或體液中的表達(dá)情況,對(duì)相關(guān)疾病的診斷、療效觀察、預(yù)后提供依據(jù)等。另外,為用抗體中和AOPPs毒性、將AOPPs抗體偶聯(lián)透析器上,發(fā)揮靶向性治療作用以及AOPP結(jié)合蛋白甚至受體的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 方法: 1.首先通過(guò)葡聚糖凝膠Hitrap 26/60 sephacryl S-300 high Resolution純化HSA,經(jīng)變性、非變性電泳確定純化后白蛋白的分子量及純度。取純化的HSA與HOCL孵育體外制備AOPPs-HSA,再用Hitrap 26/60 sephacryl S-300純化AOPPs-HSA。經(jīng)變性、非變性電泳、分子篩蛋白標(biāo)準(zhǔn)確定純化后AOPPs-HSA的分子量。并經(jīng)單核細(xì)胞株(THP-1)TNF-α分泌實(shí)驗(yàn)鑒定,純化后的AOPPs-HSA能否刺激單核細(xì)胞分泌TNF-α,促發(fā)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)的活性。 2.經(jīng)Sephacryl S 300柱純化后AOPPs-HSA分為6個(gè)峰,取純化后的AOPPs-HSA第1峰作為免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術(shù)制備抗AOPPs-HSA的McAb,用純化的AOPPs-HSA和HSA分別作為篩選抗體的檢測(cè)源,選擇與AOPPs-HSA反應(yīng)呈強(qiáng)陽(yáng)性而與HSA呈陰性的克隆,同時(shí)也選擇與AOPPs-HSA和HSA反應(yīng)呈強(qiáng)陽(yáng)性克隆。亞類鑒定采用Sigma公司的免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒。用Protein G柱純化抗體。SDS-PAGE鑒定抗體的純度。用間接ELISA、western blot鑒定抗體特異性。 3.標(biāo)記單克隆抗體,采用其中一株作為包被抗體,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的另一株作為標(biāo)記抗體,通過(guò)配對(duì)試驗(yàn),篩選出最佳配對(duì),建立雙抗體夾心法用于定量檢測(cè)人AOPPs抗原含量。優(yōu)化包被抗體和酶標(biāo)抗體的最適宜工作濃度,并進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍、檢測(cè)限等方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)。 4.用此檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)36例正常人,18例慢性腎衰但沒(méi)有透析的患者及56例透析患者之間血清AOPPs含量有無(wú)區(qū)別,并與分光光度計(jì)檢測(cè)的AOPPs比較。觀察離心前后兩種檢測(cè)方法對(duì)AOPPs的影響,比較分光光度計(jì)法與雙抗夾心法對(duì)AOPPs檢出陽(yáng)性率以及AOPPs與臨床其它指標(biāo)的相關(guān)性。 結(jié)果: 1.經(jīng)Hitrap 26/60 sephacryl S-300 high Resolution純化后HSA后分為3個(gè)峰,第三峰無(wú)論是變性電泳還是非變性電泳均只有一條帶且此條帶的分子量在55～72KD之間。表明從PAGE及SDS-PAGE看,經(jīng)純化后峰3為單一分子量的蛋白質(zhì),且其分子量約為67KD。用此純化的HSA與HOCL孵育體外制備AOPPs-HSA并經(jīng)Sephacryl S 300柱純化后分為6個(gè)峰,PAGE及SDS-PAGE結(jié)果表明純化后的1、2、3、4峰表現(xiàn)為膠頂部的復(fù)合物,說(shuō)明我們?cè)谥谱鰽OPPs的過(guò)程中用的白蛋白是比較純的,而經(jīng)過(guò)HOCL處理后白蛋白發(fā)生了結(jié)構(gòu)上的變化,變成了一個(gè)大分子的結(jié)構(gòu),故出現(xiàn)在膠的頂部。但非變性電泳膠頂部的條帶比變性電泳明顯的多,而在變性電泳中,1、2、3、4峰在55～72KD處出現(xiàn)了比較明顯的條帶,說(shuō)明此大分子的結(jié)構(gòu)在變性電泳時(shí)會(huì)有部分解聚,變成55～72KD之間的蛋白,即解聚成白蛋白的單體,但大部分仍沒(méi)有解聚。分子篩蛋白標(biāo)準(zhǔn)鑒定其分子量為670KD。 2.經(jīng)以上制備及純化后AOPPs-HSA第一峰用分光廣度計(jì)法檢測(cè)其AOPPs含量為20.38μmol/l,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照HSA樣本的3.14μmol/l。用純化后的AOPPs-HSA可顯著性誘導(dǎo)THP-1 TNF-a的分泌,未經(jīng)氧化修飾的HSA對(duì)THP-1的分泌沒(méi)有顯著性影響。時(shí)間效應(yīng)顯示AOPPs-HSA刺激6小時(shí),THP-1 TNFa的分泌量就已顯著性升高,12h升至最高水平。 3.取純化后的AOPPs-HSA第1峰免疫BALB /c小鼠,共獲得3株穩(wěn)定分泌特異性抗AOPPs的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1-C6、1-H1、3-A10,1株既抗HSA又抗AOPPs,命名為1-C5。亞類鑒定1-C5、1-C6、1-H1為IgG1, 3-A10株為IgG2b。間接ELISA交叉反應(yīng)性分析顯示,其中1-C5既與AOPPs又與HSA特異結(jié)合,其余三株均只與AOPPs特異結(jié)合,而與AOPPs-BSA、BSA、CD26親和力低,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,均有顯著性差異(p 0. 01)。western blot鑒定表明抗1-H1AOPPs-HSA抗體僅與AOPPs-HSA結(jié)合而不與HSA、AOPPs-BSA、AOPPs-RSA結(jié)合,且尿毒癥患者血清中AOPPs的水平明顯強(qiáng)于正常人。 4.采用1-H1作為包被抗體,酶標(biāo)抗體采用1-C5McAb時(shí)為最佳配對(duì),成功建立了雙抗夾心法檢測(cè)人AOPPs抗原系統(tǒng)。5μg/ml為包被抗體的最佳濃度,1:500為檢測(cè)抗體1-C5的最佳工作濃度。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法檢出限、方法回收率、方法的批內(nèi)和批間變異進(jìn)行了分析研究,結(jié)果顯示本方法最小檢出限為12 ng/ ml,標(biāo)準(zhǔn)曲線在20～300 ng/ ml范圍內(nèi)線性良好。批內(nèi)變異系數(shù)為4.8% ,批間變異系數(shù)為7.17 %,平均加樣回收率為98%,表明該方法準(zhǔn)確性高,重復(fù)性好,且實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單,容易掌握,其敏感性完全能夠滿足臨床應(yīng)用的需要。 5.分別用雙抗夾心法、分光光度計(jì)法檢測(cè)36例正常人,18例慢性腎衰但沒(méi)有透析的患者及56例透析患者,發(fā)現(xiàn)HD組和CRF組血漿AOPPs水平顯著高于正常對(duì)照組,HD組明顯高于CRF組,P0.001。18例CRF患者用分光光度計(jì)法檢出16例高于正常,而用雙抗夾心法僅檢出10例AOPPs高于正常。56例HD患者用分光廣度法檢出51例高于正常,而用雙抗夾心法僅檢出42例高于正常。經(jīng)X2檢驗(yàn),具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分光光度計(jì)檢出AOPPs陽(yáng)性率明顯高于雙抗夾心法。高速離心后用分光光度計(jì)檢測(cè)尿毒癥患者血清AOPPs值明顯較未離心的AOPPs值低,而高速離心對(duì)雙抗夾心檢測(cè)AOPPs無(wú)明顯影響。兩種檢測(cè)方法呈明顯相關(guān)(r=0.543, P0.001, n=110),血漿AOPPs水平與血清肌配水平呈正顯著正相關(guān)(r=0.664, P0.001, n=110 ),與尿素氮呈顯著正相關(guān)(r=0.606, P0.001, n=110 ),與血色素呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.535, P0.001, n=110 )。 結(jié)論: 1.經(jīng)Hitrap 26/60 sephacryl S-300 high Resolution純化后獲得了純品HSA,取此純化后的HSA與HOCL孵育體外制備AOPPs-HSA并經(jīng)Sephacryl S 300柱純化后得到相對(duì)純品AOPPs-HSA,經(jīng)變性及非變性電泳鑒定表現(xiàn)為大分子的聚合物,經(jīng)分子篩蛋白標(biāo)準(zhǔn)確定其分子量為670kD。此純化蛋白能刺激單核細(xì)胞株THP-1分泌TNF-a。 2.取純化后的AOPPs-HSA第1峰免疫BALB /c小鼠,成功篩選出3株穩(wěn)定分泌抗AOPPs-HSA,1株既抗HSA又抗AOPPs-HSA的McAb雜交瘤細(xì)胞株。所分泌的抗體亞型3株為IgG1型,1株為IgG2b。間接ELISA和Western blot實(shí)驗(yàn)證明我們制備的抗體可以特異地和天然或經(jīng)HOCL與HSA處理后純化的AOPPs結(jié)合。 3.用此單克隆單體配對(duì),建立了雙抗夾心ELISA檢測(cè)系統(tǒng),對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法檢出限、方法回收率、方法的批內(nèi)和批間變異進(jìn)行了分析研究,表明該方法準(zhǔn)確性高,重復(fù)性好,且實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單,容易掌握,其敏感性完全能夠滿足臨床應(yīng)用的需要,可作為反映病人氧化蛋白損傷的一種檢測(cè)方法。 4.雙抗夾心ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HD組和CRF組血漿AOPPs水平顯著高于正常對(duì)照組,HD組明顯高于CRF組,P0.001。分光光度計(jì)檢出AOPPs陽(yáng)性率明顯高于雙抗夾心法。經(jīng)X2檢驗(yàn),具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高速離心后用分光光度計(jì)檢測(cè)尿毒癥患者血清AOPPs值明顯較未離心的AOPPs值低,而高速離心對(duì)雙抗夾心檢測(cè)AOPPs無(wú)明顯影響。兩種檢測(cè)方法具有很好的相關(guān)性。鑒于以上結(jié)果,我們考慮分光光度計(jì)檢出率高的原因可能是由于其缺乏特異性,導(dǎo)致假陽(yáng)性,但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證。 5.本實(shí)驗(yàn)首次成功地大量純化AOPPs,制備了其單克隆抗體,建立了AOPPs單克隆抗體的工作平臺(tái),建立了雙抗夾心法檢測(cè)人AOPPs系統(tǒng),并應(yīng)用于臨床。目前國(guó)內(nèi)外均尚未有相關(guān)工作的報(bào)道。為下一步用抗體中和AOPPs毒性、將AOPPs抗體偶聯(lián)透析器上,發(fā)揮靶向性治療作用以及分離AOPP結(jié)合蛋白甚至受體的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

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10 王興波;我國(guó)獸用生物制品業(yè)面臨的選擇[N];中國(guó)畜牧報(bào);2005年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 田梅;晚期氧化蛋白產(chǎn)物單克隆抗體制備的實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

2 孫鳳霞;三聚氰胺單克隆抗體制備及其高靈敏快速檢測(cè)技術(shù)研究[D];江南大學(xué);2011年

3 楊連君;bcl-2和bax對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控及肝癌凋亡相關(guān)單克隆抗體初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

4 趙麗;抗牛PrP多肽單克隆抗體的制備及其在牛PrP檢測(cè)中的應(yīng)用[D];山東大學(xué);2004年

5 陳景波;小鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植治療去神經(jīng)節(jié)巨結(jié)腸實(shí)驗(yàn)研究[D];華中科技大學(xué);2009年

6 張德強(qiáng);骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組織工程學(xué)生物特性及其單克隆抗體制備的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2003年

7 魏拴增;1.六株胰腺癌細(xì)胞系和30例中國(guó)人胰腺癌的K-ras基因第12、13密碼子突變模式的研究 2.23例脾臟淋巴瘤的T細(xì)胞受體，免疫球蛋白重鏈和輕鏈的單克隆重排檢測(cè)[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

8 劉文森;蓖麻毒素單克隆抗體制備、檢測(cè)方法及單鏈抗體研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

9 于翠;番茄花葉病毒（ToMV）和黃瓜花葉病毒（CMV）單克隆抗體制備及ToMV在煙草上致病分子機(jī)理研究[D];浙江大學(xué);2004年

10 邵吉民;大腸癌相關(guān)基因ST13/SNC6表達(dá)的蛋白質(zhì)研究[D];浙江大學(xué);2001年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳曉亮;腫瘤源性早孕因子單克隆抗體制備及鑒定[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2011年

2 陳亮;雞CARP單克隆抗體制備及其在骨骼肌發(fā)育中的表達(dá)[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2010年

3 詹峰;抗GDF15單克隆抗體制備及功能鑒定[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

4 朱麗潔;豬TNF-α單克隆抗體制備與PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α變化規(guī)律研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

5 張鳳鳳;左氧氟沙星單克隆抗體制備及鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

6 劉建新;光對(duì)裙帶菜排卵的干擾及單克隆擴(kuò)增、育苗條件優(yōu)化[D];中國(guó)科學(xué)院海洋研究所;2001年

7 韓述嶺;抗腫瘤壞死因子-α單克隆抗體減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

8 孔雙泉;重組CHO細(xì)胞高效表達(dá)乙肝表面抗原的研究[D];吉林大學(xué);2004年

9 汪亮;重組酶刪除載體的構(gòu)建及其在動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

10 盛明巍;三聚氰胺單克隆抗體制備及間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的初步建立[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

本文編號(hào)：1578096