發(fā)布時間：2018-03-07 01:26

  本文選題：脂肪　切入點：干細胞　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的研究人脂肪干細胞的基本生物學(xué)特性、表面抗原特點及其向成骨細胞和脂肪細胞誘導(dǎo)分化潛能。 方法①取健康人腹部皮下脂肪組織,膠原酶消化法分離出脂肪干細胞,進行體外培養(yǎng),觀察其形態(tài)特征。②cck—8比色法檢測1、3、6、10代脂肪干細胞活性,并繪制細胞生長曲線,計算群體倍增時間。③流式細胞儀檢測第1、3、6代脂肪干細胞的細胞周期及表面抗原,SPSS11.0軟件分析數(shù)據(jù)。④取第3代人脂肪干細胞,分別用成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)其向成骨細胞和脂肪細胞分化,cck—8比色法檢測誘導(dǎo)后的細胞活性,并繪制細胞生長曲線,計算群體倍增時間;RT-PCR檢測人脂肪干細胞誘導(dǎo)后成骨細胞特異性骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)及骨保護素(Osteoprotegerin,OPG)基因的表達和脂肪細胞特異性過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)基因與CCAAT增強子結(jié)合蛋白(C/EBPa)基因的表達,Western-blot進一步檢測OPG蛋白的表達;堿性磷酸酶(ALP)染色、馮庫薩(Von Kossa)染色、油紅O染色定性鑒定其成骨和成脂分化潛能。 結(jié)果①形態(tài)特征:原代及傳代的人脂肪干細胞形態(tài)均類似成纖維細胞,生長能力旺盛。②生長曲線及倍增時間:1、3、6、10代人脂肪干細胞的生長曲線大致相同,呈近似“S”形,群體倍增時間約為36h。③細胞周期分析:第1、3、6代人脂肪干細胞中,超過80%的細胞都處于G0/G1期。④表面抗原:第1、3、6代脂肪干細胞表面抗原表達無明顯區(qū)別,P＞0.05。其中,CD10、CD13、CD55、CD59及CD71表達陽性,CD11b、CD14、CD18、CD34、CD45、CD56及HLA-DR表達陰性。⑤誘導(dǎo)分化:人脂肪干細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細胞增殖速度變慢,群體倍增時間延長至約66h,誘導(dǎo)14d后,RT-PCR檢測到OCN、OPN基因的表達,同時,RT-PCR、Western-blot檢測到OPG基因與蛋白的表達,ALP染色和Von Kossa染色陽性;人脂肪干細胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)后,細胞增殖速度同樣變慢,群體倍增時間延長至約70h,誘導(dǎo)14d后,RT-PCR檢測到PPARγ與C/EBPa基因的表達,油紅O染色陽性。 結(jié)論人腹部皮下脂肪組織可分離培養(yǎng)出脂肪干細胞,大多細胞處于靜止期,表面抗原CD10、CD13、CD55、CD59、CD71表達呈陽性,CD11b、CD14、CD18、CD34、CD45、CD56、HLA-DR表達呈陰性,體外培養(yǎng)和傳代對其表面抗原的表達無明顯影響,能向成骨細胞和脂肪細胞誘導(dǎo)分化,有望成為組織工程理想的種子細胞來源之一。
[Abstract]:Objective to study the basic biological characteristics, surface antigen characteristics and differentiation potential of human adipose stem cells into osteoblasts and adipocytes. Methods 1 adipose stem cells were isolated from healthy human abdominal subcutaneous adipose tissue and cultured in vitro by collagenase digestion. The morphological characteristics of adipose stem cells were measured by 2cck-8 colorimetry, and the growth curve of adipose stem cells was plotted. The cell cycle and surface antigen of adipose stem cells of passage 1 and 3 were analyzed by flow cytometry with population doubling time 3. 3. The third generation of human adipose stem cells were analyzed by SPSS 11.0 software. Osteoblasts and adipocytes were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes by cck-8 colorimetry, and cell growth curves were plotted. Expression of osteocalcinin-specific osteocalcin OCNN, osteopontinin Osteoprotegerin Osteoprotegerin OPGG gene and adipocyte specific peroxisome proliferator activated receptor 緯 (PPAR 緯) in human adipose stem cells induced by human adipose stem cells were determined by RT-PCR. The expression of C / EBPA gene and CCAAT enhancer binding protein was further detected by Western-blot. Alkaline phosphatase (ALP) staining, Von Kossa staining and oil red O staining were used to identify their osteogenic and adipogenic potential. Results 1Morphologic characteristics: the morphology of primary and passage human adipose stem cells was similar to that of fibroblasts, and the growth curve of human adipose stem cells was similar to that of fibroblasts, and the growth curve of human adipose stem cells was similar to that of "S". The population doubling time was about 36h.3 cell cycle analysis: in the first and third generation of human adipose stem cells, More than 80% cells were in G _ 0 / G _ 1 phase .4 surface antigen: there was no significant difference in the expression of surface antigen of adipose stem cells in the 1st and 6th generation of adipose stem cells (P > 0.05). Among them, the positive expression of CD10, CD13, CD55, CD59, and CD71 expression were induced by CD11bP14, CD18, CD34, CD45, CD56 and HLA-DR expression negative. 5. The differentiation of human adipose stem cells was induced by osteogenesis. After 14 days of induction, the expression of OCN-OPN gene was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and the expression of OPG gene and protein was detected by RT-PCR and Von Kossa staining. The cell proliferation rate also slowed down, the population doubling time was prolonged to about 70 h. After 14 days of induction, the expression of PPAR 緯 and C% EBPA gene was detected by RT-PCR, and the oil red O staining was positive. Conclusion ASCs can be isolated and cultured from human abdominal subcutaneous adipose tissue. Most of the cells are in the stationary phase. The positive expression of CD10, CD13, CD5, CD59, CD71, and CD11bt4, CD14, CD34, CD34, CD45, CD56, and HLA-DR are negative, but the expression of surface antigen is not affected by culture and passage in vitro. It can induce differentiation into osteoblasts and adipocytes, which is expected to be one of the ideal seed cells for tissue engineering.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：1577360