本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點：平滑肌細(xì)胞　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 尿失禁是女性的常見病,據(jù)報道全世界患者有2億以上,其中又以壓力性尿失禁為主,已成為重要的婦女健康問題,影響生活質(zhì)量。導(dǎo)致SUI的關(guān)鍵機制主要有兩種,尿道固有括約肌缺陷(intrinsic sphincter deficiency,ISD)和膀胱頸支撐功能障礙。目前,治療SUI的方法包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療,但這些方法均只能解決膀胱頸支撐功能障礙,不能糾正ISD,因此長期療效不理想,且并發(fā)癥多。利用干細(xì)胞的再生潛能,修復(fù)括約肌缺陷,治療SUI已經(jīng)成為目前尿失禁研究的熱點。 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)為成體干細(xì)胞的一種,是一群來源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞,它們可以在體外經(jīng)誘導(dǎo)后最終分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌管、神經(jīng)細(xì)胞與支持造血干細(xì)胞的基質(zhì)。MSCs具有取材方便、擴增迅速、可自體移植等特點,因此,利用MSCs的多向分化的特性及通過基因修飾能在體外表達(dá)多種外源目的基因的特性,將其作為種子細(xì)胞用于細(xì)胞治療和基因治療的研究已成為當(dāng)前研究的熱點。但是目前的研究的中,體外誘導(dǎo)它分化產(chǎn)生的平滑肌細(xì)胞在數(shù)量和功能上均難以達(dá)到改善治療壓力性尿失禁的目的�，F(xiàn)階段的研究已證實移植的MSCs能在組織微環(huán)境中分化成與其周圍細(xì)胞生物學(xué)特性相似的細(xì)胞,認(rèn)為干細(xì)胞能夠?qū)Νh(huán)境中的調(diào)節(jié)信號做出適應(yīng)性改變,而其分子機制尚不清楚,因此本研究模仿體內(nèi)細(xì)胞生存的微環(huán)境,將其向SMCs誘導(dǎo),初步探討細(xì)胞間接觸在MSCs向SMCs分化中的作用,為MSCs作為種子細(xì)胞用于組織工程研究提供理論基礎(chǔ)。 本研究以SD大鼠為研究對象,分別利用密度梯度離心法和酶消化法,分離培養(yǎng)了BMSCs和BSMCs;模仿體內(nèi)細(xì)胞生長的微環(huán)境,建立大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化的體外共培養(yǎng)模型,在共培養(yǎng)前后,檢測膀胱平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)BMSCs的成肌分化標(biāo)志蛋白表達(dá)變化;在共培養(yǎng)的基礎(chǔ)上阻斷細(xì)胞間縫隙連接,檢測抑制細(xì)胞間連接后對BMSCs向SMCs分化情況的影響。主要實驗方法及結(jié)果如下: 一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和膀胱平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 1.無菌條件下取一月齡雌性SD大鼠雙側(cè)股骨,沖出骨髓,采用密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞,DMEM-12培養(yǎng),獲得貼壁細(xì)胞,監(jiān)測細(xì)胞生長曲線,流式細(xì)胞儀檢測其免疫表型,采用不同條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞向成脂、成骨分化。和生長情況。結(jié)果:分離的骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)后呈紡錘體樣,其分子免疫表型為: CD44、CD90陽性;CD31、CD45陰性。在不同的誘導(dǎo)條件下,BMSCs可形成脂滴、骨結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu),成功分離并培養(yǎng)了BMSCs。 2.無菌條件下取一月齡雌性SD大鼠膀胱,采用胰酶消化法分離單個核細(xì)胞,HG-DMEM培養(yǎng),獲得貼壁細(xì)胞,監(jiān)測細(xì)胞生長曲線,免疫熒光法鑒定其標(biāo)志蛋白的表達(dá)。結(jié)果:平滑肌特異性的a-SMA, Calponin和SM-MHC表達(dá)陽性,證實分離并培養(yǎng)了膀胱平滑肌細(xì)胞。 二、BMSCs向SMCs分化的體外共培養(yǎng)模型的建立與鑒定 1.建立大鼠BSMCs誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化的體外共培養(yǎng)模型,在共培養(yǎng)前后,檢測BSMCs誘導(dǎo)BMSCs的成肌分化標(biāo)志蛋白表達(dá)變化。以懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室transwell底層的多孔膜(1um)作為BMSCs和BSMCs之間的間隔,細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,膠原等物質(zhì)可通過膜上的孔相流通,多孔膜上下兩面的細(xì)胞可通過膜上的孔進(jìn)行細(xì)胞間接觸,但細(xì)胞不能通過。將BMSCs和BSMCs分別接種于多孔膜兩側(cè)作為接觸共培養(yǎng)實驗組,將BMSCs接種于多孔膜上,BSMCs接種于六孔板底,使得兩種細(xì)胞仍處在一個培養(yǎng)環(huán)境中,之間距離900μm,兩種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子仍可以通過多孔膜膜孔相互影響,但是不發(fā)生接觸作為非接觸共培養(yǎng)實驗組,以單獨培養(yǎng)的BMSCs作為對照組,在共培養(yǎng)的第4天和第8天的免疫熒光法和Western blot法檢測BMSCs中平滑肌特異性蛋白的表達(dá)情況,在共培養(yǎng)1,2,3天檢測實驗組中BMSCs的平滑肌特異性蛋白基因的表達(dá)情況。結(jié)果:免疫熒光法、Western blot法和qRT-PCR均顯示隨共培養(yǎng)時間的延長,接觸組的BMSCs中SMC特異的蛋白的表達(dá)量增加,而非接觸組與共培養(yǎng)前無明顯變化,提示細(xì)胞間的接觸在誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化方面起了重要的作用。 2.正庚醇阻斷細(xì)胞間縫隙連接對BMSCs向SMCs分化的影響。初步實驗證明細(xì)胞間接觸共培養(yǎng)可以很好的誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化,正庚醇阻斷縫隙連接后可以有明顯的抑制BMSCs向SMCs分化,進(jìn)一步證明縫隙連接在在誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化方面起了重要的作用。 結(jié)論:本研究通過模擬體內(nèi)細(xì)胞生長分化的微環(huán)境環(huán)境,建立了大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化的體外共培養(yǎng)模型,證明了BMSCs與平滑肌細(xì)胞間的直接接觸是誘導(dǎo)分化的重要因素之一,利用這種方法可進(jìn)一步深入研究MSCs的分化機制,提高分化效率,為BMSCs移植治療壓力性尿失禁提供理論支持。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 段繼宏,楊勇,吳士良,潘柏年,那彥群,薛兆英,郭應(yīng)祿;北京地區(qū)尿失禁發(fā)病率調(diào)查[J];北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2000年01期

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本文編號：1574793