本文選題：凝集素　切入點(diǎn)：MGL　出處：《東北師范大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：樹突細(xì)胞（DC)是機(jī)體內(nèi)重要的抗原遞呈細(xì)胞，在機(jī)體的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。DC表面表達(dá)豐富的模式識(shí)別受體（PRRs)，主要包括Toll樣受體（TLRs)和C-型凝集素受體（CLRs)。其中，，TLRs主要是通過與病原體的相互作用介導(dǎo)免疫激活，有利于病原體的清除，而CLRs則更傾向于介導(dǎo)機(jī)體的免疫耐受。近些年來的研究表明，CLR家族的一個(gè)成員，巨噬細(xì)胞半乳糖型凝集素（MGL)，參與了多種病原體的免疫逃逸。 在本研究中，我們構(gòu)建了4種MGL原核表達(dá)載體，用以選擇MGL表達(dá)的最佳條件，其次，構(gòu)建了2種MGL真核表達(dá)載體，用于不同類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。 我們首先從外周血中分離單核細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)成為未成熟樹突細(xì)胞（iDC)，然后提取iDC總RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)PCR獲得MGL胞外基因片段，通過酶切連接構(gòu)建了2種帶有MGL胞外區(qū)的原核表達(dá)載體pET-28a(+)-MGL (胞外）和pGEX-6p-l-MGL (胞外）。將其在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)蛋白表達(dá)形式分析發(fā)現(xiàn)，目的蛋白均以包涵體形式存在。為獲得可溶性的目的蛋白，我們又構(gòu)建了帶有MGL全長(zhǎng)基因片段的pET-28a(+)-MGL和pGEX-6p-l-MGL2種原核表達(dá)載體，通過在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白表達(dá)形式分析發(fā)現(xiàn)，只有pGEX-6p-l-MGL表達(dá)的目的蛋白大部分以可溶性形式存在。隨后，將其轉(zhuǎn)化菌體表達(dá)的上清蛋白，經(jīng)GST瓊脂糖親和層析的方法進(jìn)行純化，得到GST-MGL融合蛋白，并通過WestemBlot驗(yàn)證即為目的蛋白。在原核表達(dá)載體構(gòu)建的基礎(chǔ)上，我們又構(gòu)建帶有MGL全長(zhǎng)的2種真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-MGL和pWPXLd-MGL。其中pcDNA3.1(+)-MGL適合于貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，而pWPXLd-MGL適合于懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。 MGL原核表達(dá)體系的構(gòu)建對(duì)同類型凝集素的原核表達(dá)提供了設(shè)計(jì)思路，而且pGEX-6p-l-MGL原核表達(dá)載體表達(dá)的GST-MGL融合蛋白，可通過其標(biāo)簽GST的pulldown實(shí)驗(yàn)，研究與MGL共作用的受體和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。其真核表達(dá)載體可用于穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建，對(duì)于研究依賴于MGL的細(xì)胞與細(xì)胞的識(shí)別以及MGL介導(dǎo)的信號(hào)通路均有重要意義。
[Abstract]:Dendritic cells (DC) are important antigen presenting cells in the body. It plays a key role in the immune response of the body. The pattern recognition receptor (PRRsN), which is abundant on the surface of DC, mainly includes the Toll like receptor (TLRs) and the C- type lectin receptor (C- lectin receptor), in which TLRs are mainly mediated by interaction with pathogens. In recent years, CLRs, a member of the macrophage galactose lectin, is involved in the immune escape of many pathogens. In this study, we constructed four MGL prokaryotic expression vectors to select the best conditions for MGL expression. Secondly, we constructed two MGL eukaryotic expression vectors for transfection of different types of cells. We first isolated monocytes from peripheral blood, induced by cytokines into immature dendritic cells, then extracted iDC total RNA and reverse transcripted it to cDNA.The extracellular gene fragment of MGL was obtained by PCR. Two prokaryotic expression vectors pET-28awith extracellular domain of MGL (pET-28a) and pGEX-6p-l-MGL (extracellular) were constructed by enzyme ligation. The expression of pET-28aand pGEX-6p-l-MGL were induced in Escherichia coli, and the expression forms of pET-28aand pGEX-6p-l-MGL were analyzed. In order to obtain the soluble target protein, we constructed the prokaryotic expression vector pET-28a (MGL and pGEX-6p-l-MGL2) with full-length MGL gene fragment. The results of induction expression and protein expression analysis in E. coli showed that only the target protein expressed by pGEX-6p-l-MGL existed in soluble form, and then the supernatant protein was transformed into the supernatant. The fusion protein of GST-MGL was purified by GST agarose affinity chromatography. The fusion protein was identified as the target protein by WestemBlot. The fusion protein was constructed on the basis of prokaryotic expression vector. We also constructed two eukaryotic expression vectors pcDNA3.1 (pWPXLd-MGLand pWPXLd-MGL) with full length of MGL, in which pcDNA3.1 (MGL is suitable for transfection of adherent cells and pWPXLd-MGL is suitable for transfection of suspension cells). The construction of MGL prokaryotic expression system provides a design idea for the prokaryotic expression of the same type lectin, and the GST-MGL fusion protein expressed by the pGEX-6p-l-MGL prokaryotic expression vector can be obtained through the pulldown experiment with the label GST. The eukaryotic expression vector can be used in the construction of stable cell line, and it is of great significance to study the recognition of MGL dependent cells and the signal pathway mediated by MGL.
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：Q78;R392

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本文編號(hào)：1566191