本文選題：凝集素　切入點：MGL　出處：《東北師范大學》2013年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：樹突細胞（DC)是機體內(nèi)重要的抗原遞呈細胞，在機體的免疫應答中起關鍵作用。DC表面表達豐富的模式識別受體（PRRs)，主要包括Toll樣受體（TLRs)和C-型凝集素受體（CLRs)。其中，，TLRs主要是通過與病原體的相互作用介導免疫激活，有利于病原體的清除，而CLRs則更傾向于介導機體的免疫耐受。近些年來的研究表明，CLR家族的一個成員，巨噬細胞半乳糖型凝集素（MGL)，參與了多種病原體的免疫逃逸。 在本研究中，我們構建了4種MGL原核表達載體，用以選擇MGL表達的最佳條件，其次，構建了2種MGL真核表達載體，用于不同類型細胞的轉染。 我們首先從外周血中分離單核細胞，經(jīng)細胞因子誘導成為未成熟樹突細胞（iDC)，然后提取iDC總RNA并將其逆轉錄為cDNA。經(jīng)PCR獲得MGL胞外基因片段，通過酶切連接構建了2種帶有MGL胞外區(qū)的原核表達載體pET-28a(+)-MGL (胞外）和pGEX-6p-l-MGL (胞外）。將其在大腸桿菌中誘導表達，經(jīng)蛋白表達形式分析發(fā)現(xiàn)，目的蛋白均以包涵體形式存在。為獲得可溶性的目的蛋白，我們又構建了帶有MGL全長基因片段的pET-28a(+)-MGL和pGEX-6p-l-MGL2種原核表達載體，通過在大腸桿菌中誘導表達和蛋白表達形式分析發(fā)現(xiàn)，只有pGEX-6p-l-MGL表達的目的蛋白大部分以可溶性形式存在。隨后，將其轉化菌體表達的上清蛋白，經(jīng)GST瓊脂糖親和層析的方法進行純化，得到GST-MGL融合蛋白，并通過WestemBlot驗證即為目的蛋白。在原核表達載體構建的基礎上，我們又構建帶有MGL全長的2種真核表達載體pcDNA3.1(+)-MGL和pWPXLd-MGL。其中pcDNA3.1(+)-MGL適合于貼壁細胞的轉染，而pWPXLd-MGL適合于懸浮細胞的轉染。 MGL原核表達體系的構建對同類型凝集素的原核表達提供了設計思路，而且pGEX-6p-l-MGL原核表達載體表達的GST-MGL融合蛋白，可通過其標簽GST的pulldown實驗，研究與MGL共作用的受體和胞內(nèi)信號轉導蛋白。其真核表達載體可用于穩(wěn)轉細胞系的構建，對于研究依賴于MGL的細胞與細胞的識別以及MGL介導的信號通路均有重要意義。
[Abstract]:Dendritic cells (DC) are important antigen presenting cells in the body. It plays a key role in the immune response of the body. The pattern recognition receptor (PRRsN), which is abundant on the surface of DC, mainly includes the Toll like receptor (TLRs) and the C- type lectin receptor (C- lectin receptor), in which TLRs are mainly mediated by interaction with pathogens. In recent years, CLRs, a member of the macrophage galactose lectin, is involved in the immune escape of many pathogens. In this study, we constructed four MGL prokaryotic expression vectors to select the best conditions for MGL expression. Secondly, we constructed two MGL eukaryotic expression vectors for transfection of different types of cells. We first isolated monocytes from peripheral blood, induced by cytokines into immature dendritic cells, then extracted iDC total RNA and reverse transcripted it to cDNA.The extracellular gene fragment of MGL was obtained by PCR. Two prokaryotic expression vectors pET-28awith extracellular domain of MGL (pET-28a) and pGEX-6p-l-MGL (extracellular) were constructed by enzyme ligation. The expression of pET-28aand pGEX-6p-l-MGL were induced in Escherichia coli, and the expression forms of pET-28aand pGEX-6p-l-MGL were analyzed. In order to obtain the soluble target protein, we constructed the prokaryotic expression vector pET-28a (MGL and pGEX-6p-l-MGL2) with full-length MGL gene fragment. The results of induction expression and protein expression analysis in E. coli showed that only the target protein expressed by pGEX-6p-l-MGL existed in soluble form, and then the supernatant protein was transformed into the supernatant. The fusion protein of GST-MGL was purified by GST agarose affinity chromatography. The fusion protein was identified as the target protein by WestemBlot. The fusion protein was constructed on the basis of prokaryotic expression vector. We also constructed two eukaryotic expression vectors pcDNA3.1 (pWPXLd-MGLand pWPXLd-MGL) with full length of MGL, in which pcDNA3.1 (MGL is suitable for transfection of adherent cells and pWPXLd-MGL is suitable for transfection of suspension cells). The construction of MGL prokaryotic expression system provides a design idea for the prokaryotic expression of the same type lectin, and the GST-MGL fusion protein expressed by the pGEX-6p-l-MGL prokaryotic expression vector can be obtained through the pulldown experiment with the label GST. The eukaryotic expression vector can be used in the construction of stable cell line, and it is of great significance to study the recognition of MGL dependent cells and the signal pathway mediated by MGL.
【學位授予單位】：東北師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：Q78;R392

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 胡以平,姚玉成;TNF家族的新成員TRAIL cDNA的克隆及其在E.coli中的表達[J];癌變畸變突變;2000年02期

2 吳嵐曉,李明,王萍,陳白虹;人胰島素樣生長因子-1基因的克隆及其表達[J];中國生化藥物雜志;2002年01期

3 陳廣生,隋延仿,葉菁,張秀敏,宋宏萍;MAGE-1與結核桿菌HSP70融合基因的構建及原核表達[J];免疫學雜志;2003年05期

4 林林,鄭紅英,陳炯,陳劍平;大蒜E病毒外殼蛋白基因的原核表達及抗血清制備[J];微生物學報;2004年04期

5 錢冬萌,侯偉,閆志勇,趙百慧,付強,王斌;26肽蜂毒素與基因變構IL-2嵌合蛋白的原核表達、純化及活性測定[J];中國生物工程雜志;2004年10期

6 殷月蘭,焦新安,潘志明,張曉明,顧志強,陳瑤;李斯特菌溶血素基因的原核表達及其生物學特性[J];微生物學報;2004年06期

7 林鑒,葛勝祥,王穎彬,羅文新,吳婷,李少偉,程通,張軍,夏寧邵;SARS冠狀病毒核衣殼(N)蛋白不同區(qū)域的原核表達[J];病毒學報;2005年02期

8 王軼,羅勤,吳俊,郭經(jīng)宇,楊毅,李旭鋒;甘藍型油菜植物防御素基因的克隆與原核表達[J];四川大學學報(自然科學版);2005年04期

9 高俊偉;畢丁仁;胡思順;彭秀麗;;雞毒霉形體黏附素截短蛋白表達條件的優(yōu)化[J];華中農(nóng)業(yè)大學學報;2007年04期

10 牟藤;沈國順;陳長蘭;;人硒蛋白SelK在大腸桿菌中的高效表達[J];硅谷;2008年05期

相關會議論文 前10條

1 辛英豪;高繼明;劉標;李莎莎;姜世金;;Ⅰ型鴨病毒性肝炎VP1基因的克隆與原核表達[A];山東畜牧獸醫(yī)學會禽病學專業(yè)委員會第一次學術研討會論文集[C];2009年

2 焦石;賈立軍;薛書江;劉明明;黃國明;張守發(fā);;牛源犬新孢子蟲MAG1基因的克隆及原核表達[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜寄生蟲學分會第六次代表大會暨第十一次學術研討會論文集[C];2011年

3 彭躍躍;丁q

本文編號：1566191