本文選題：法氏囊　切入點(diǎn)：囊素　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：法氏囊(bursa of Fabricus, BF)是禽類獨(dú)有的中樞免疫器官,其功能類似與哺乳動(dòng)物中的骨髓。三肽囊素作為BF組織中分離唯一已知的活性分子,無種屬特異性,不僅對(duì)禽類具有免疫調(diào)節(jié)功能,而且對(duì)哺乳動(dòng)物及人類淋巴細(xì)胞也具有明顯的免疫學(xué)及生理學(xué)活性。其具有獨(dú)特組成結(jié)構(gòu),氨基酸組成順序?yàn)長(zhǎng)ys:His:Gly:NH2,其中Lys:His:Gly:NH2為1：0.9：1：0.8。目前,對(duì)于囊素免疫學(xué)功能的研究主要集中在禽類促進(jìn)體液免疫方面,至于其在哺乳細(xì)胞中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,還尚需深入研究,有關(guān)囊素發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不清楚,囊素是否與其它多肽一樣存在膜受體以及是否通過受體介導(dǎo)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)還未可知。這些都極大的限制了囊素作為免疫活性分子在臨床的廣泛應(yīng)用前景。趙明軍等利用噬菌體展示技術(shù)篩選與BS單克隆抗體特異性結(jié)合肽,發(fā)現(xiàn)“TXNL”肽是與BS單克隆抗體特異性結(jié)合的保守序列。競(jìng)爭(zhēng)ELISA表明,該“TXNL”肽在一定程度上可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制BS與BS單克隆抗體結(jié)合。生物活性試驗(yàn)表明,該“TXNL”肽與BS也具有類似的生物學(xué)作用。提示,對(duì)囊素模擬肽的研究可闊寬囊素的應(yīng)用前景,同時(shí)對(duì)于囊素免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究具有積極意義。 本研究,基于囊素和模擬肽分子設(shè)計(jì)幾種囊素樣肽,通過基因工程串連表達(dá)后,在小鼠模型中,研究其作為免疫佐劑在哺乳動(dòng)物中的對(duì)乙腦亞單位疫苗和禽流感滅活疫苗的免疫調(diào)節(jié)作用,通過其對(duì)小鼠細(xì)胞免疫水平、體液免疫水平以及免疫保護(hù)力的檢測(cè),評(píng)價(jià)其作為新型多肽免疫佐劑的潛能。同時(shí)以囊素分子為靶標(biāo),利用噬菌體展示技術(shù),研究與之相互作用蛋白,為揭示囊素作用機(jī)制和進(jìn)一步的囊素生物學(xué)功能研究提供新的線索。研究主要從以下幾個(gè)方面展開： 1囊素樣肽基因的設(shè)計(jì)及在大腸桿菌中的表達(dá) 按大腸桿菌慣用密碼子通過SOE-PCR方法合成三種囊素樣肽基因,108 bp的(K-H-G)10基因由10拷貝的BS(K-H-G)串聯(lián),上下游分別帶有EcoRI和Sall site位點(diǎn)。116 bp的(T-X-N-L)8基因由8拷貝的BS模擬肽(T-X-N-L)串聯(lián),上下游分別帶有EcoRI和HindⅢ位點(diǎn)。125bp的(T-X-N-L-K-H-G) 5基因由5拷貝的(T-X-N-L-K-H-G)串聯(lián),經(jīng)測(cè)序證明序列正確后,克隆至pET32a載體中,三種重組表達(dá)載體在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE電泳證實(shí),三種融合蛋白主要以可溶形式存在,分別為24.9、25.2和25.5 KDa大小。融合蛋白經(jīng)Ni2-NTA親合柱純化,Western blot結(jié)果表明三種融合蛋白與bursin有著相似的免疫反應(yīng)性。通過基因工程的方法得到囊素樣肽的表達(dá)產(chǎn)物,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。 2囊素樣肽對(duì)乙腦亞單位疫苗的免疫效果影響 為探討囊素樣肽的免疫調(diào)節(jié)作用,在小鼠模型中評(píng)價(jià)其對(duì)乙腦亞單位疫苗的免疫效果影響。通過檢測(cè)保護(hù)性抗體JEV-E滴度、抗體亞型(IgG1和IgG2a)、淋巴細(xì)胞增殖、INF-γ和IL-4細(xì)胞因子的表達(dá)水平、T細(xì)胞亞型發(fā)現(xiàn)。使用三種囊素樣肽能都明顯提高JEV-BD免疫小鼠的特異性免疫反應(yīng)。IgG2a和細(xì)胞因子1NF-γ水平表明JEV-BD主要刺激Thl型免疫反應(yīng)。而囊素樣肽能明顯增加小鼠的Th2反應(yīng)。尤其是(T-X-N-L-K-H-G)5肽能平衡2種類型的免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)示,囊素樣肽作為佐劑能明顯增強(qiáng)JEV亞單位疫苗免疫小鼠的免疫反應(yīng),有望能成為一個(gè)有潛力的疫苗佐劑。 3囊素樣肽有效提高禽流感H9N2滅活疫苗對(duì)小鼠的免疫保護(hù) 為進(jìn)一步研究囊素樣肽的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,4-6周齡小鼠隨機(jī)分為6組,每組30只。用不同劑量合成的囊素樣肽T-P-N-L-K-H-G與禽流感H9N2滅活病毒(W1V)混合后分別以肌肉接種的方式給小鼠進(jìn)行3次免疫,同時(shí)設(shè)兩組對(duì)照組小鼠,分別免疫PBS和常規(guī)滅活疫苗。最后一次免疫后1周攻毒。然后通過測(cè)定HI血清效價(jià)、HA抗體和抗體亞型、Thl和Th2類型細(xì)胞因子分泌水平、脾T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞變化、細(xì)胞特異性CTL活性以及攻毒保護(hù)力來評(píng)價(jià)囊素樣肽作為分子佐劑的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,肽佐劑能平衡IgG1和IgG2a的分泌水平。單獨(dú)WIV抗原免疫主要誘導(dǎo)小鼠Thl類型細(xì)胞因子的產(chǎn)生,而肽佐劑能明顯提高WIV抗原免疫后小鼠兩種類型細(xì)胞因子的分泌水平,但對(duì)IL-10分泌水平?jīng)]有促進(jìn)作用。肽佐劑能有效促進(jìn)WIV抗原免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞CD4+和CD8+亞群的分化。對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞的增殖也具有調(diào)節(jié)作用。中、低劑量肽佐劑聯(lián)合WIV抗原免疫后,可以誘發(fā)小鼠產(chǎn)生較好的針對(duì)H9N2病毒的特異性CTL反應(yīng),其殺傷率明顯高于單獨(dú)WIV抗原免疫組和H9N2疫苗組。小鼠攻毒后肺臟病毒含量檢測(cè)顯示,囊素樣肽有助于WIV抗原免疫后小鼠肺臟病毒的清除。以上結(jié)果證實(shí)合成的囊素樣肽通過介導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)顯著提高禽流感H9N2滅活病毒對(duì)小鼠的免疫保護(hù)。但囊素樣肽免疫調(diào)節(jié)作用不存在劑量依賴關(guān)系,高劑量對(duì)免疫作用有一定的抑制。對(duì)囊素樣肽的作用劑量關(guān)系還需進(jìn)一步研究。 4小鼠雜交瘤細(xì)胞膜Bursin受體的表達(dá) 囊素能有效促雜交瘤細(xì)胞抗體的分泌,因而研究雜瘤細(xì)胞膜是否具有囊素受體的表達(dá),對(duì)于全面闡清囊素促雜交瘤細(xì)胞抗體分泌的信號(hào)傳導(dǎo)通路尤為重要。采用熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析的方法,檢測(cè)囊素與雜交瘤細(xì)胞膜相結(jié)合的情況以及二者的結(jié)合特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),BS能特異結(jié)合在雜交瘤細(xì)胞膜上,與雜交瘤細(xì)胞的結(jié)合率不隨有劑量效應(yīng)關(guān)系且有飽和趨向性。加入FITC-BS在400ug/m、600ug/ml濃度時(shí)結(jié)合率達(dá)到最高。結(jié)合率分別為51.0%、50.6%。二者的結(jié)合率無顯著差異(P0.05)。而當(dāng)加入人工合成的BS,在高于400ug/ml濃度時(shí)能明顯抑制FITC-BS與雜交瘤細(xì)胞的結(jié)合,抑制率呈顯著差異(P0.05)。表明,BS與雜交瘤細(xì)胞的結(jié)合具有可逆性。因而,我們初步推測(cè)雜交瘤細(xì)胞膜上存在著特異的結(jié)合蛋白,該蛋白很可能是囊素的受體,參與了囊素促雜交瘤細(xì)胞抗體分泌過程。 5囊素結(jié)合肽的篩選及活性鑒定 以囊素分子作為靶標(biāo),對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫進(jìn)行親和篩選,經(jīng)過4輪篩選,隨機(jī)挑取20個(gè)克隆,ELISA法鑒定其親和性,結(jié)果篩選得10個(gè)能與囊素較強(qiáng)結(jié)合的噬菌體克隆,競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)證實(shí)其中2個(gè)克隆能競(jìng)爭(zhēng)人工合成的多肽BS與囊素的結(jié)合。對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行序列分析,推導(dǎo)的氨基酸序列分別為ACTKHLCLLQPL; MSCNDTLCLLPN;其保守序列為L(zhǎng)CLL。體外實(shí)驗(yàn)表明,2個(gè)人工合成的結(jié)合肽都能在一定程度上抑制囊素與雜交瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合,這進(jìn)一步證實(shí)雜交瘤細(xì)胞有囊素結(jié)合的受體,同時(shí)也提示,“LCLL”保守基序很可能是囊素細(xì)胞膜受體結(jié)合位點(diǎn)。 6 B淋巴細(xì)胞中囊素結(jié)合蛋白的篩選 B淋巴細(xì)胞是囊素相當(dāng)重要的作用靶細(xì)胞,為研究囊素在B淋巴細(xì)胞中的作用機(jī)制及相互作用蛋白,利用噬菌體表面展示技術(shù),以純化的TRX-BS融合蛋白為靶蛋白,對(duì)雞B細(xì)胞噬菌體T7 cDNA文庫進(jìn)行生物篩選,噬菌體經(jīng)過3輪篩選后出現(xiàn)明顯生物富集,隨機(jī)挑選第三輪篩選的10個(gè)噬斑裂解液做PCR擴(kuò)增,將其PCR產(chǎn)物序列測(cè)定后進(jìn)行同源搜索,初步確定了2個(gè)與bursin結(jié)合的蛋白,為3-羥基異丁基-輔酶A水解酶(3-hydroxyisobutyryl-Coenzyme A hydrolase)和含EGF腓素樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1(similar to EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1, EFEMP1)。為進(jìn)一步研究bursin勺生物學(xué)功能提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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