發(fā)布時間：2018-03-04 14:12

  本文選題：法氏囊　切入點：囊素　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：法氏囊(bursa of Fabricus, BF)是禽類獨有的中樞免疫器官,其功能類似與哺乳動物中的骨髓。三肽囊素作為BF組織中分離唯一已知的活性分子,無種屬特異性,不僅對禽類具有免疫調(diào)節(jié)功能,而且對哺乳動物及人類淋巴細(xì)胞也具有明顯的免疫學(xué)及生理學(xué)活性。其具有獨特組成結(jié)構(gòu),氨基酸組成順序為Lys:His:Gly:NH2,其中Lys:His:Gly:NH2為1：0.9：1：0.8。目前,對于囊素免疫學(xué)功能的研究主要集中在禽類促進(jìn)體液免疫方面,至于其在哺乳細(xì)胞中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,還尚需深入研究,有關(guān)囊素發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不清楚,囊素是否與其它多肽一樣存在膜受體以及是否通過受體介導(dǎo)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)還未可知。這些都極大的限制了囊素作為免疫活性分子在臨床的廣泛應(yīng)用前景。趙明軍等利用噬菌體展示技術(shù)篩選與BS單克隆抗體特異性結(jié)合肽,發(fā)現(xiàn)“TXNL”肽是與BS單克隆抗體特異性結(jié)合的保守序列。競爭ELISA表明,該“TXNL”肽在一定程度上可以競爭性抑制BS與BS單克隆抗體結(jié)合。生物活性試驗表明,該“TXNL”肽與BS也具有類似的生物學(xué)作用。提示,對囊素模擬肽的研究可闊寬囊素的應(yīng)用前景,同時對于囊素免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究具有積極意義。 本研究,基于囊素和模擬肽分子設(shè)計幾種囊素樣肽,通過基因工程串連表達(dá)后,在小鼠模型中,研究其作為免疫佐劑在哺乳動物中的對乙腦亞單位疫苗和禽流感滅活疫苗的免疫調(diào)節(jié)作用,通過其對小鼠細(xì)胞免疫水平、體液免疫水平以及免疫保護(hù)力的檢測,評價其作為新型多肽免疫佐劑的潛能。同時以囊素分子為靶標(biāo),利用噬菌體展示技術(shù),研究與之相互作用蛋白,為揭示囊素作用機(jī)制和進(jìn)一步的囊素生物學(xué)功能研究提供新的線索。研究主要從以下幾個方面展開： 1囊素樣肽基因的設(shè)計及在大腸桿菌中的表達(dá) 按大腸桿菌慣用密碼子通過SOE-PCR方法合成三種囊素樣肽基因,108 bp的(K-H-G)10基因由10拷貝的BS(K-H-G)串聯(lián),上下游分別帶有EcoRI和Sall site位點。116 bp的(T-X-N-L)8基因由8拷貝的BS模擬肽(T-X-N-L)串聯(lián),上下游分別帶有EcoRI和HindⅢ位點。125bp的(T-X-N-L-K-H-G) 5基因由5拷貝的(T-X-N-L-K-H-G)串聯(lián),經(jīng)測序證明序列正確后,克隆至pET32a載體中,三種重組表達(dá)載體在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE電泳證實,三種融合蛋白主要以可溶形式存在,分別為24.9、25.2和25.5 KDa大小。融合蛋白經(jīng)Ni2-NTA親合柱純化,Western blot結(jié)果表明三種融合蛋白與bursin有著相似的免疫反應(yīng)性。通過基因工程的方法得到囊素樣肽的表達(dá)產(chǎn)物,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。 2囊素樣肽對乙腦亞單位疫苗的免疫效果影響 為探討囊素樣肽的免疫調(diào)節(jié)作用,在小鼠模型中評價其對乙腦亞單位疫苗的免疫效果影響。通過檢測保護(hù)性抗體JEV-E滴度、抗體亞型(IgG1和IgG2a)、淋巴細(xì)胞增殖、INF-γ和IL-4細(xì)胞因子的表達(dá)水平、T細(xì)胞亞型發(fā)現(xiàn)。使用三種囊素樣肽能都明顯提高JEV-BD免疫小鼠的特異性免疫反應(yīng)。IgG2a和細(xì)胞因子1NF-γ水平表明JEV-BD主要刺激Thl型免疫反應(yīng)。而囊素樣肽能明顯增加小鼠的Th2反應(yīng)。尤其是(T-X-N-L-K-H-G)5肽能平衡2種類型的免疫反應(yīng)。實驗結(jié)果預(yù)示,囊素樣肽作為佐劑能明顯增強(qiáng)JEV亞單位疫苗免疫小鼠的免疫反應(yīng),有望能成為一個有潛力的疫苗佐劑。 3囊素樣肽有效提高禽流感H9N2滅活疫苗對小鼠的免疫保護(hù) 為進(jìn)一步研究囊素樣肽的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,4-6周齡小鼠隨機(jī)分為6組,每組30只。用不同劑量合成的囊素樣肽T-P-N-L-K-H-G與禽流感H9N2滅活病毒(W1V)混合后分別以肌肉接種的方式給小鼠進(jìn)行3次免疫,同時設(shè)兩組對照組小鼠,分別免疫PBS和常規(guī)滅活疫苗。最后一次免疫后1周攻毒。然后通過測定HI血清效價、HA抗體和抗體亞型、Thl和Th2類型細(xì)胞因子分泌水平、脾T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞變化、細(xì)胞特異性CTL活性以及攻毒保護(hù)力來評價囊素樣肽作為分子佐劑的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,肽佐劑能平衡IgG1和IgG2a的分泌水平。單獨WIV抗原免疫主要誘導(dǎo)小鼠Thl類型細(xì)胞因子的產(chǎn)生,而肽佐劑能明顯提高WIV抗原免疫后小鼠兩種類型細(xì)胞因子的分泌水平,但對IL-10分泌水平?jīng)]有促進(jìn)作用。肽佐劑能有效促進(jìn)WIV抗原免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞CD4+和CD8+亞群的分化。對小鼠脾淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞的增殖也具有調(diào)節(jié)作用。中、低劑量肽佐劑聯(lián)合WIV抗原免疫后,可以誘發(fā)小鼠產(chǎn)生較好的針對H9N2病毒的特異性CTL反應(yīng),其殺傷率明顯高于單獨WIV抗原免疫組和H9N2疫苗組。小鼠攻毒后肺臟病毒含量檢測顯示,囊素樣肽有助于WIV抗原免疫后小鼠肺臟病毒的清除。以上結(jié)果證實合成的囊素樣肽通過介導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)顯著提高禽流感H9N2滅活病毒對小鼠的免疫保護(hù)。但囊素樣肽免疫調(diào)節(jié)作用不存在劑量依賴關(guān)系,高劑量對免疫作用有一定的抑制。對囊素樣肽的作用劑量關(guān)系還需進(jìn)一步研究。 4小鼠雜交瘤細(xì)胞膜Bursin受體的表達(dá) 囊素能有效促雜交瘤細(xì)胞抗體的分泌,因而研究雜瘤細(xì)胞膜是否具有囊素受體的表達(dá),對于全面闡清囊素促雜交瘤細(xì)胞抗體分泌的信號傳導(dǎo)通路尤為重要。采用熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析的方法,檢測囊素與雜交瘤細(xì)胞膜相結(jié)合的情況以及二者的結(jié)合特性。實驗結(jié)果證實,BS能特異結(jié)合在雜交瘤細(xì)胞膜上,與雜交瘤細(xì)胞的結(jié)合率不隨有劑量效應(yīng)關(guān)系且有飽和趨向性。加入FITC-BS在400ug/m、600ug/ml濃度時結(jié)合率達(dá)到最高。結(jié)合率分別為51.0%、50.6%。二者的結(jié)合率無顯著差異(P0.05)。而當(dāng)加入人工合成的BS,在高于400ug/ml濃度時能明顯抑制FITC-BS與雜交瘤細(xì)胞的結(jié)合,抑制率呈顯著差異(P0.05)。表明,BS與雜交瘤細(xì)胞的結(jié)合具有可逆性。因而,我們初步推測雜交瘤細(xì)胞膜上存在著特異的結(jié)合蛋白,該蛋白很可能是囊素的受體,參與了囊素促雜交瘤細(xì)胞抗體分泌過程。 5囊素結(jié)合肽的篩選及活性鑒定 以囊素分子作為靶標(biāo),對噬菌體隨機(jī)12肽庫進(jìn)行親和篩選,經(jīng)過4輪篩選,隨機(jī)挑取20個克隆,ELISA法鑒定其親和性,結(jié)果篩選得10個能與囊素較強(qiáng)結(jié)合的噬菌體克隆,競爭抑制試驗證實其中2個克隆能競爭人工合成的多肽BS與囊素的結(jié)合。對陽性克隆進(jìn)行測序并進(jìn)行序列分析,推導(dǎo)的氨基酸序列分別為ACTKHLCLLQPL; MSCNDTLCLLPN;其保守序列為LCLL。體外實驗表明,2個人工合成的結(jié)合肽都能在一定程度上抑制囊素與雜交瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合,這進(jìn)一步證實雜交瘤細(xì)胞有囊素結(jié)合的受體,同時也提示,“LCLL”保守基序很可能是囊素細(xì)胞膜受體結(jié)合位點。 6 B淋巴細(xì)胞中囊素結(jié)合蛋白的篩選 B淋巴細(xì)胞是囊素相當(dāng)重要的作用靶細(xì)胞,為研究囊素在B淋巴細(xì)胞中的作用機(jī)制及相互作用蛋白,利用噬菌體表面展示技術(shù),以純化的TRX-BS融合蛋白為靶蛋白,對雞B細(xì)胞噬菌體T7 cDNA文庫進(jìn)行生物篩選,噬菌體經(jīng)過3輪篩選后出現(xiàn)明顯生物富集,隨機(jī)挑選第三輪篩選的10個噬斑裂解液做PCR擴(kuò)增,將其PCR產(chǎn)物序列測定后進(jìn)行同源搜索,初步確定了2個與bursin結(jié)合的蛋白,為3-羥基異丁基-輔酶A水解酶(3-hydroxyisobutyryl-Coenzyme A hydrolase)和含EGF腓素樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1(similar to EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1, EFEMP1)。為進(jìn)一步研究bursin勺生物學(xué)功能提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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2 高舜德,黃浙;雞胚法氏囊提取液對法氏囊復(fù)生的研究[J];山東大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);1981年01期

3 吳石金;諶南輝;;法式囊三肽囊素(bursin)在兔圓小囊、腸相關(guān)淋巴組織(蚓突)中免疫組化定位特征研究(英文)[J];Journal of Shanghai University(English Edition);2007年02期

4 繆德年,陳溥言,繆德年,張秀根,姚惠娟,樊生超,張德明;囊素和法氏囊超濾物對雜交瘤細(xì)胞抗體分泌的影響[J];上海農(nóng)業(yè)學(xué)報;2002年03期

5 張紅衛(wèi),徐譽(yù)泰,王海仁;牛肝提取物提高仔雞免疫力的研究[J];實驗生物學(xué)報;1995年02期

6 諶南輝,吳石金;三肽囊素(bursin)的雞、鴨免疫器官組織學(xué)定位特征分析(簡報)[J];實驗生物學(xué)報;2003年02期

7 諶南輝,郭松林,吳石金;法氏囊三肽囊素在鴨體中的組織學(xué)定位及功能的研究[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2003年01期

8 張德明,戴亞斌,繆德年,陳溥言;法氏囊提取物提高仔豬體液免疫力的初步研究[J];畜牧與獸醫(yī);2002年07期

9 鐘彥偉,成軍,陳新華,王剛,洪源,王琳,李莉,張玲霞,陳菊梅;應(yīng)用噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)篩選丙肝病毒NS3抗原模擬表位[J];中國病毒學(xué);2002年03期

10 鄭其升,劉華雷,張曉勇,周斌,曹瑞兵,任雪楓,李鵬,陳溥言;H_9N_2亞型AIV HA基因的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立[J];中國病毒學(xué);2005年03期

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本文編號：1565968