本文選題：基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)　切入點(diǎn)：腎臟　出處：《中南大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 背景和目的：腎臟衰老是機(jī)體衰老的重要組成部分。腎臟是高度血管化的器官,隨增齡腎臟出現(xiàn)微血管生成障礙,主要表現(xiàn)為局灶性腎小管周及腎小球毛細(xì)血管密度減少,腎小球毛細(xì)血管床面積減少,管腔閉塞�；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)是一種多功能因子,是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的內(nèi)源性抑制劑。通過(guò)MMPs依賴和非MMPs依賴途徑參與多種病理生理過(guò)程,其中包括抑制血管生成。我們以往研究發(fā)現(xiàn),隨增齡TIMP-1的基因和蛋白水平及酶活性均升高,通過(guò)炎癥途徑促進(jìn)衰老相關(guān)腎臟纖維化,參與腎臟衰老發(fā)展進(jìn)程。但是腎臟器官衰老過(guò)程中TIMP-1表達(dá)上調(diào)是否參與腎臟增齡性血管生成障礙,其機(jī)制如何,目前尚不清楚。與張力蛋白同源、第10號(hào)染色體丟失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10, PTEN)是一種抑癌基因,其編碼蛋白為雙重底物特異性磷酸酶,具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白質(zhì)磷酸酶活性。近期研究表明,PTEN突變或表達(dá)下調(diào),腫瘤血管生成增加；隨增齡大鼠和人胃粘膜PTEN表達(dá)上調(diào),粘膜血流量下降,組織缺氧。另外,體外研究發(fā)現(xiàn)TIMP-1可上調(diào)PTEN的蛋白表達(dá),而這與其MMPs抑制活性無(wú)關(guān)。提示,隨增齡,TIMP-1可能通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)參與組織器官的增齡性血管生成障礙。目前,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道TIMP-1通過(guò)PTEN途徑參與腎臟器官衰老過(guò)程。基于以上認(rèn)識(shí),我們假設(shè),TIMP-1有可能通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)影響衰老相關(guān)腎臟微血管生成障礙。本研究以PTEN為切入點(diǎn),通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察人TIMP-1轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟微血管生成隨增齡的變化及與PTEN的關(guān)系,研究正、反義人TIMP-1基因轉(zhuǎn)染人近端腎小管上皮細(xì)胞(HKC)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)PTEN的表達(dá)及對(duì)血管生成的影響,進(jìn)一步探討TIMP-1對(duì)腎臟器官衰老的影響機(jī)制。 方法：(1)留取3、12、24月齡人TIMP-1轉(zhuǎn)基因小鼠(每組n=8)和野生型小鼠(每組n=8)腎組織。石蠟切片行PAS及VEGF、CD34免疫組化染色；RT-PCR、Western Blot方法檢測(cè)腎組織內(nèi)TIMP-1、MMP-9、MMP-2、PTEN、VEGF、Flk-1mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。(2)將正義和反義人TIMP-1基因轉(zhuǎn)染至人近端腎小管上皮細(xì)胞(HKC)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)中,同時(shí)用與正義轉(zhuǎn)染組細(xì)胞酶抑制活性相當(dāng)?shù)腗MP-2/MMP-9抑制劑(MMP-2/MMP-9 InhibitorⅢ, 100μM)干預(yù)24小時(shí),RT-PCR、Western Blot方法檢測(cè)TIMP-1、MMP-2、MMP-9、PTEN、VEGF、Flk-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)；間接免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞PTEN、VEGF和Flk-1的表達(dá)；明膠酶譜法檢測(cè)培養(yǎng)上清中明膠酶的活性。(3)將PTEN siRNA轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達(dá)人正義TIMP-1的人近端腎小管上皮細(xì)胞(HKC)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)中,RT-PCR、Western Blot方法檢測(cè)TIMP-1、PTEN、VEGF、Flk-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。(4)體外三維血管生成實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染人正、反義TIMP-1和MMP-2/MMP-9 InhibitorⅢ(10μM)干預(yù)ECV304細(xì)胞的血管生成情況。 結(jié)果：人TIMP-1轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠隨增齡腎組織內(nèi)出現(xiàn)微血管生成障礙,表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管袢計(jì)數(shù)減少,腎小管周微血管密度(MCV)下降,稀疏指數(shù)增加；然而,在24月齡時(shí),轉(zhuǎn)基因小鼠腎小球毛細(xì)血管袢計(jì)數(shù)低于野生型小鼠(18.57±3.52 vs25.58±4.22；P0.05),管周毛細(xì)血管稀疏指數(shù)高于野生型小鼠(41.72±8.276 vs 32.96±5.58；P0.05)。另外,與野生型小鼠相比,24月齡時(shí),轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織內(nèi)TIMP-1的表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05),明膠酶(MMP-2,9)的表達(dá)下調(diào)(P0.05),PTEN的表達(dá)上調(diào)(P0.05), VEGF和Flk-1表達(dá)下調(diào)(P0.05)。體外研究顯示,與未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染組相比,正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組中PTEN表達(dá)上調(diào)(P0.05),明膠酶活性降低(P0.05),VEGF和Flk-1表達(dá)下調(diào)(P0.05),而反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組則相反(P0.05)；MMP-2/MMP-9 inhibitorⅢ100μM(酶抑制劑組)組PTEN、VEGF和Flk-1表達(dá)與未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染組相比無(wú)顯著差異,而明膠酶活性與正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯差異。PTEN SiRNA轉(zhuǎn)染后,與未轉(zhuǎn)染和對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組PTEN表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05),而VEGF和Flk-1表達(dá)上調(diào)(P0.05)。體外三維血管生成實(shí)驗(yàn)顯示,與未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染組相比,反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組小管總長(zhǎng)度明顯增加(4.29±0.35mm,P0.05),酶抑制劑組、正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組小管總長(zhǎng)度減少(P0.05),酶抑制組小管總長(zhǎng)度高于正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組(1.71±0.22mm,0.95±0.09mm,P0.05)。 結(jié)論：腎臟器官衰老過(guò)程中高表達(dá)的TIMP-1,通過(guò)上調(diào)PTEN(非MMP依賴途徑),進(jìn)而下調(diào)VEGF、Flk-1表達(dá),腎小球毛細(xì)血管袢減少、管腔塌陷,管周微血管密度下降、小管萎縮,最終導(dǎo)致腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化。提示PTEN在TIMP-1介導(dǎo)腎臟衰老微血管生成障礙中起重要作用,首次證實(shí)PTEN表達(dá)上調(diào)參與腎臟衰老過(guò)程。本研究為揭示TIMP-1參與腎臟器官衰老分子機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R339.38

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1565616