本文關(guān)鍵詞： 純紅細(xì)胞再生障礙性貧血 K562細(xì)胞 誘導(dǎo) 定向分化 血型抗體 血型基因 熒光定量PCR 凋亡 機(jī)制　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 背景 ABO血型系統(tǒng)位于第九染色體上(9q34.1-9q34.2), ABO血型抗原有三種類型,分別是水溶性糖蛋白、醇溶性糖蛋白和膜糖蛋白。ABO血型抗原均以H物質(zhì)作為基礎(chǔ)物質(zhì),H物質(zhì)由19號(hào)染色體上的FUT基因座編碼的α2-L-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(α2-L-fucosyltransferase,α2-FUT)作用于血型前體物質(zhì)而產(chǎn)生。ABO血型抗體分為天然抗體和免疫性抗體,天然抗體屬于IgM性質(zhì)的抗體,免疫性抗體屬于IgG性質(zhì)的抗體。ABO血型抗原不依賴HLA基因復(fù)合物遺傳,在HLA相合異基因造血干細(xì)胞移植中供受者主要ABO不合者約占11.7%-28%。純紅細(xì)胞再生障礙性貧血(pure red cell aplasia, PRCA)是主要ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植的主要并發(fā)癥之一,異基因造血干細(xì)胞移植后PRCA的發(fā)生機(jī)制還未完全明了,但它可能與受者凝集素(抗體)與供者紅細(xì)胞的ABO抗原不匹配有關(guān)。有報(bào)道A型和B型抗原表達(dá)于紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E),紅細(xì)胞系集落形成單位(CFU-E)和部分不斷分化的抗原陽(yáng)性細(xì)胞上,ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植后發(fā)生純紅再障原因可能與受者體內(nèi)殘余的B淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞等抗體分泌細(xì)胞有關(guān),這些細(xì)胞可以繼續(xù)生成同種不匹配的凝集素(抗體)而與供者紅細(xì)胞ABO抗原發(fā)生作用。 目前的研究表明移植后PRCA的總發(fā)生率為8%,且這種并發(fā)癥主要發(fā)生在主側(cè)而不是雙側(cè)ABO血型不合的造血干細(xì)胞移植(hemopoietic stem cell transplantation, HSCT)患者�，F(xiàn)已確認(rèn)的PRCA兩個(gè)主要危險(xiǎn)性因素是移植前未降低同種凝集素(抗體)的效價(jià)和A或AB型供者干細(xì)胞移植給0型受者。含抗A凝集素(抗體)的受者合并高發(fā)生率的PRCA原因可用抗A抗體比抗B抗體的濃度高且持續(xù)時(shí)間久來解釋�？构┱咄N凝集素(抗體)效價(jià)在PRCA中的作用已在文獻(xiàn)中多次報(bào)道,IgM中位滴度是1：128(1：2-1：4096)，IgG是1：512(1：2-1：16000),這些效價(jià)是使用各種不同的技術(shù)評(píng)定的。大部分作者提出移植前高效價(jià)的同種凝集素(抗體)是所觀察到的PRCA的一個(gè)主要影響因素,但還沒有病例能清晰地將PRCA的發(fā)生率和高效價(jià)之間的相關(guān)性進(jìn)行深入的研究 A和B抗原是由A、B基因座位上的等位基因分別編碼的寡糖基轉(zhuǎn)移酶作用于H抗原而形成的。紅細(xì)胞等組織細(xì)胞膜上的脂溶性H抗原與體液、分泌液中的水溶性H抗原的產(chǎn)生,分別受控于由H(FUT1)和Se(FUT2)位點(diǎn)的等位基因編碼的兩種特異性不同的α2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α2-FUT)作用。 H抗原是在α1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下,將GDP-L-fucose上的巖藻糖基轉(zhuǎn)移到前體糖鏈上而形成的。α1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的受控基因有2個(gè)(FUTl和FUT2),其中FUT1基因控制H抗原在紅系組織表達(dá),而FUT2基因(或Se基因)控制H抗原在分泌液中的表達(dá)。FUT1基因定位于19號(hào)染色體,有4個(gè)外顯子,而蛋白質(zhì)編碼序列位于第4外顯子,糖基轉(zhuǎn)移酶分子由365個(gè)氨基酸組成。人體內(nèi)存在與FUT1高度同源的FUT2基因,FUTl和FUT2基因的產(chǎn)物均為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,該酶將巖藻糖連接到糖鏈前身物質(zhì)而形成H抗原。FUTl基因控制紅細(xì)胞膜上H抗原的表達(dá),而FUT2基因控制分泌液中巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。H血型抗原唯一依賴的是FUTl基因的產(chǎn)物FUT1酶的作用,無活性的FUT1等位基因在純合子狀態(tài)不能表達(dá)H抗原,無活性的FUT2基因不會(huì)影響紅細(xì)胞表面H抗原的表達(dá),只會(huì)影響體液中H抗原的表達(dá)。 H抗原與ABO血型關(guān)系密切,是A和B抗原的前身物,ABO基因位于染色體9q34上而決定H抗原表達(dá)的FUTl和FUT2基因位于染色體19q13.3, FUT1和FUT2基因間隔不到100kb,二者70%的核苷酸序列相同。前者編碼365個(gè)氨基酸構(gòu)成a(1，2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,后者編碼332個(gè)氨基酸構(gòu)成a(1，，2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,因各自作用的底物不同,最終使得FUT1基因決定H抗原在紅細(xì)胞上的表達(dá),FUT2基因決定H抗原在分泌腺和消化液中的表達(dá) 巖藻糖轉(zhuǎn)移酶是調(diào)節(jié)碳水化合物合成的關(guān)鍵酶,基于它們的受體特異性和他們的主要氨基酸序列,它們被分為兩大家族：a(1，2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(FUT1和FUT2)和a(1,3)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(FUT3, FUT4, FUT5, FUT6和UT7),它們分別參與H物質(zhì)和Lewis相關(guān)抗原的合成。目前,7種巖藻糖轉(zhuǎn)移酶已被各自定位和復(fù)制,FUT1是把巖藻糖從GDP巖藻糖轉(zhuǎn)移到Ⅱ型雙糖末端半乳糖的H基因編碼的a(1,2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,這種酶對(duì)Ⅰ型雙糖活性很低。另一個(gè)a(1，2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶FUT2是由分泌基因(Se)編碼,從GDP巖藻糖轉(zhuǎn)移到Ⅰ型雙糖末端半乳糖。FUT3是一個(gè)a(1,3/1,4)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,相當(dāng)于Lewis型巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,它可以將更多的轉(zhuǎn)移殘余巖藻糖到Ⅰ型雙糖N-乙酰氨基葡萄糖,用于Lewis x, Lewis y, Lewis a, Lewis b, sialyl-Lewis x和sialyl-Lewis a抗原的合成。FUT4是a(1,3)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,作用于Lewi s x和Lewis y的合成。FUT5和FUT6是另外兩個(gè)a(1,3)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,可以合成Lewis x和sialyl-Lewis x,而FUT7僅能合成sialyl-Lewis x。 主要ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植后患者發(fā)生純紅細(xì)胞再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)不明,推測(cè)與體液免疫機(jī)制介導(dǎo)的紅系前體細(xì)胞破壞和抑制有關(guān),PRCA患者自身ABO血型抗體抑制了供者型紅細(xì)胞在體內(nèi)的生成和血型的轉(zhuǎn)換,但缺乏實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。K562細(xì)胞株是一種人紅白血病細(xì)胞系,基本處于多能髓樣祖細(xì)胞階段而停止繼續(xù)分化,然而一些極性化合物如氯化高鐵血紅素(Hemin)可以誘導(dǎo)其向紅系分化。在誘導(dǎo)劑作用下,K562細(xì)胞向紅系分化成熟的不同階段,其基因表達(dá)譜會(huì)發(fā)生不同的變化。本研究擬用氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系定向分化,觀察ABO血型抗體對(duì)K562細(xì)胞紅系定向分化的干預(yù)作用,研究血型抗體對(duì)紅系分化成熟和對(duì)血型基因表達(dá)的影響,本研究有助于揭示ABO血型不合移植后PRCA的發(fā)生機(jī)制。 目的 研究ABO血型抗體對(duì)K562細(xì)胞紅系定向分化的干預(yù)作用機(jī)制,探討不匹配的ABO血型抗體對(duì)紅系分化成熟過程的干預(yù)作用機(jī)制和對(duì)血型抗原表達(dá)的影響,從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)入手探討PRCA的體液免疫作用機(jī)制。 方法 1.含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)K562細(xì)胞株。 2.使用不同濃度的Hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系定向分化,通過聯(lián)苯胺染色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的含量來檢測(cè)K562細(xì)胞紅系定向分化的成熟度。 3.血型抗原檢測(cè)法：使用吸收放散實(shí)驗(yàn)、微量淋巴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)后K562細(xì)胞表面ABO血型抗原。 4.使用測(cè)序的方法檢測(cè)K562細(xì)胞株的ABO血型。 5.采用常規(guī)MTT法測(cè)定K562細(xì)胞在不同濃度抗H作用下的細(xì)胞增殖抑制率。 6.用Trizol法提取不同濃度抗H作用于誘導(dǎo)后K562細(xì)胞的總RNA。 7.使用SYBR GREEN熒光定量PCR法檢測(cè)不同濃度抗H作用于誘導(dǎo)后K562細(xì)胞FUTl基因的相對(duì)表達(dá)量。 8.使用Annexin V/PI法檢測(cè)不同濃度抗H作用于誘導(dǎo)后K562細(xì)胞的凋亡 結(jié)果 1.不同濃度hemin誘導(dǎo)不同天數(shù)的K562細(xì)胞后K562細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白合成量不同,以50uM/L誘導(dǎo)K562細(xì)胞4d后細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白合成量最高。 2.誘導(dǎo)后K562細(xì)胞表面血型抗原表達(dá)過弱,其ABO血型抗原用吸收放散試驗(yàn),微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)等常規(guī)方法無法檢測(cè)到。采用基因測(cè)序方法確認(rèn)K562細(xì)胞株ABO血型為0型。 3.MTT檢測(cè)K562細(xì)胞經(jīng)hemin誘導(dǎo)及不同濃度的抗H試劑作用后,1：8與1：16稀釋組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)抗H稀釋度≤1：8時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。 4.熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示不同稀釋度抗H作用于誘導(dǎo)不同天數(shù)后的K562細(xì)胞,FUT1基因的表達(dá)量有明顯的變化,當(dāng)抗H稀釋度≤1：16時(shí),對(duì)細(xì)胞FUT1基因的表達(dá)有明顯的抑制作用。 5.細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示,抗-H抗體可促使紅系定向分化后的K562細(xì)胞凋亡,隨加入的抗-H試劑稀釋度的增高,細(xì)胞凋亡率明顯降低,當(dāng)抗-H抗體1：16倍稀釋以上時(shí),細(xì)胞凋亡率無明顯差異。 結(jié)論 1.不同濃度的Hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系定向分化的效果不同。 2.ABO血型抗體對(duì)經(jīng)誘導(dǎo)后向紅系定向分化的K562細(xì)胞的增殖有抑制作用。K562細(xì)胞在向紅系定向分化過程中代表紅細(xì)胞特異性的細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的合成量有明顯提高,但其細(xì)胞表面血型抗原的表達(dá)卻很弱。 3. K562細(xì)胞在向紅系定向分化過程中,表達(dá)H抗原的FUT1基因表達(dá)量有所增加,但一定濃度的抗H抗體可以抑制FUT1基因的表達(dá)。 4.在一定濃度范圍內(nèi),ABO血型抗體可通過細(xì)胞凋亡途徑抑制K562細(xì)胞向紅系定向分化成熟。細(xì)胞試驗(yàn)證明ABO血型抗體可抑制干細(xì)胞紅系定向分化成熟,ABO血型抗體可能在PRCA的發(fā)生中起重要作用。 5.本研究建立的FUT1基因熒光定量檢測(cè)方法可檢測(cè)出基因表達(dá)量的變化,為研究紅細(xì)胞表面ABO血型基因表達(dá)建立了新方法。 6.本研究為臨床ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植后PRCA發(fā)生機(jī)制提供了新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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