本文關(guān)鍵詞： 純紅細胞再生障礙性貧血 K562細胞 誘導(dǎo) 定向分化 血型抗體 血型基因 熒光定量PCR 凋亡 機制　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 背景 ABO血型系統(tǒng)位于第九染色體上(9q34.1-9q34.2), ABO血型抗原有三種類型,分別是水溶性糖蛋白、醇溶性糖蛋白和膜糖蛋白。ABO血型抗原均以H物質(zhì)作為基礎(chǔ)物質(zhì),H物質(zhì)由19號染色體上的FUT基因座編碼的α2-L-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(α2-L-fucosyltransferase,α2-FUT)作用于血型前體物質(zhì)而產(chǎn)生。ABO血型抗體分為天然抗體和免疫性抗體,天然抗體屬于IgM性質(zhì)的抗體,免疫性抗體屬于IgG性質(zhì)的抗體。ABO血型抗原不依賴HLA基因復(fù)合物遺傳,在HLA相合異基因造血干細胞移植中供受者主要ABO不合者約占11.7%-28%。純紅細胞再生障礙性貧血(pure red cell aplasia, PRCA)是主要ABO血型不合異基因造血干細胞移植的主要并發(fā)癥之一,異基因造血干細胞移植后PRCA的發(fā)生機制還未完全明了,但它可能與受者凝集素(抗體)與供者紅細胞的ABO抗原不匹配有關(guān)。有報道A型和B型抗原表達于紅細胞系爆裂樣生成單位(BFU-E),紅細胞系集落形成單位(CFU-E)和部分不斷分化的抗原陽性細胞上,ABO血型不合異基因造血干細胞移植后發(fā)生純紅再障原因可能與受者體內(nèi)殘余的B淋巴細胞或漿細胞等抗體分泌細胞有關(guān),這些細胞可以繼續(xù)生成同種不匹配的凝集素(抗體)而與供者紅細胞ABO抗原發(fā)生作用。 目前的研究表明移植后PRCA的總發(fā)生率為8%,且這種并發(fā)癥主要發(fā)生在主側(cè)而不是雙側(cè)ABO血型不合的造血干細胞移植(hemopoietic stem cell transplantation, HSCT)患者�，F(xiàn)已確認的PRCA兩個主要危險性因素是移植前未降低同種凝集素(抗體)的效價和A或AB型供者干細胞移植給0型受者。含抗A凝集素(抗體)的受者合并高發(fā)生率的PRCA原因可用抗A抗體比抗B抗體的濃度高且持續(xù)時間久來解釋�？构┱咄N凝集素(抗體)效價在PRCA中的作用已在文獻中多次報道,IgM中位滴度是1：128(1：2-1：4096)，IgG是1：512(1：2-1：16000),這些效價是使用各種不同的技術(shù)評定的。大部分作者提出移植前高效價的同種凝集素(抗體)是所觀察到的PRCA的一個主要影響因素,但還沒有病例能清晰地將PRCA的發(fā)生率和高效價之間的相關(guān)性進行深入的研究 A和B抗原是由A、B基因座位上的等位基因分別編碼的寡糖基轉(zhuǎn)移酶作用于H抗原而形成的。紅細胞等組織細胞膜上的脂溶性H抗原與體液、分泌液中的水溶性H抗原的產(chǎn)生,分別受控于由H(FUT1)和Se(FUT2)位點的等位基因編碼的兩種特異性不同的α2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α2-FUT)作用。 H抗原是在α1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下,將GDP-L-fucose上的巖藻糖基轉(zhuǎn)移到前體糖鏈上而形成的。α1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的受控基因有2個(FUTl和FUT2),其中FUT1基因控制H抗原在紅系組織表達,而FUT2基因(或Se基因)控制H抗原在分泌液中的表達。FUT1基因定位于19號染色體,有4個外顯子,而蛋白質(zhì)編碼序列位于第4外顯子,糖基轉(zhuǎn)移酶分子由365個氨基酸組成。人體內(nèi)存在與FUT1高度同源的FUT2基因,FUTl和FUT2基因的產(chǎn)物均為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,該酶將巖藻糖連接到糖鏈前身物質(zhì)而形成H抗原。FUTl基因控制紅細胞膜上H抗原的表達,而FUT2基因控制分泌液中巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。H血型抗原唯一依賴的是FUTl基因的產(chǎn)物FUT1酶的作用,無活性的FUT1等位基因在純合子狀態(tài)不能表達H抗原,無活性的FUT2基因不會影響紅細胞表面H抗原的表達,只會影響體液中H抗原的表達。 H抗原與ABO血型關(guān)系密切,是A和B抗原的前身物,ABO基因位于染色體9q34上而決定H抗原表達的FUTl和FUT2基因位于染色體19q13.3, FUT1和FUT2基因間隔不到100kb,二者70%的核苷酸序列相同。前者編碼365個氨基酸構(gòu)成a(1，2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,后者編碼332個氨基酸構(gòu)成a(1，，2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,因各自作用的底物不同,最終使得FUT1基因決定H抗原在紅細胞上的表達,FUT2基因決定H抗原在分泌腺和消化液中的表達 巖藻糖轉(zhuǎn)移酶是調(diào)節(jié)碳水化合物合成的關(guān)鍵酶,基于它們的受體特異性和他們的主要氨基酸序列,它們被分為兩大家族：a(1，2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(FUT1和FUT2)和a(1,3)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(FUT3, FUT4, FUT5, FUT6和UT7),它們分別參與H物質(zhì)和Lewis相關(guān)抗原的合成。目前,7種巖藻糖轉(zhuǎn)移酶已被各自定位和復(fù)制,FUT1是把巖藻糖從GDP巖藻糖轉(zhuǎn)移到Ⅱ型雙糖末端半乳糖的H基因編碼的a(1,2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,這種酶對Ⅰ型雙糖活性很低。另一個a(1，2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶FUT2是由分泌基因(Se)編碼,從GDP巖藻糖轉(zhuǎn)移到Ⅰ型雙糖末端半乳糖。FUT3是一個a(1,3/1,4)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,相當(dāng)于Lewis型巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,它可以將更多的轉(zhuǎn)移殘余巖藻糖到Ⅰ型雙糖N-乙酰氨基葡萄糖,用于Lewis x, Lewis y, Lewis a, Lewis b, sialyl-Lewis x和sialyl-Lewis a抗原的合成。FUT4是a(1,3)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,作用于Lewi s x和Lewis y的合成。FUT5和FUT6是另外兩個a(1,3)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,可以合成Lewis x和sialyl-Lewis x,而FUT7僅能合成sialyl-Lewis x。 主要ABO血型不合異基因造血干細胞移植后患者發(fā)生純紅細胞再生障礙性貧血發(fā)病機不明,推測與體液免疫機制介導(dǎo)的紅系前體細胞破壞和抑制有關(guān),PRCA患者自身ABO血型抗體抑制了供者型紅細胞在體內(nèi)的生成和血型的轉(zhuǎn)換,但缺乏實驗室證據(jù)。K562細胞株是一種人紅白血病細胞系,基本處于多能髓樣祖細胞階段而停止繼續(xù)分化,然而一些極性化合物如氯化高鐵血紅素(Hemin)可以誘導(dǎo)其向紅系分化。在誘導(dǎo)劑作用下,K562細胞向紅系分化成熟的不同階段,其基因表達譜會發(fā)生不同的變化。本研究擬用氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細胞向紅系定向分化,觀察ABO血型抗體對K562細胞紅系定向分化的干預(yù)作用,研究血型抗體對紅系分化成熟和對血型基因表達的影響,本研究有助于揭示ABO血型不合移植后PRCA的發(fā)生機制。 目的 研究ABO血型抗體對K562細胞紅系定向分化的干預(yù)作用機制,探討不匹配的ABO血型抗體對紅系分化成熟過程的干預(yù)作用機制和對血型抗原表達的影響,從細胞實驗入手探討PRCA的體液免疫作用機制。 方法 1.含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)K562細胞株。 2.使用不同濃度的Hemin誘導(dǎo)K562細胞向紅系定向分化,通過聯(lián)苯胺染色法測定細胞內(nèi)血紅蛋白的含量來檢測K562細胞紅系定向分化的成熟度。 3.血型抗原檢測法：使用吸收放散實驗、微量淋巴細胞毒實驗檢測誘導(dǎo)后K562細胞表面ABO血型抗原。 4.使用測序的方法檢測K562細胞株的ABO血型。 5.采用常規(guī)MTT法測定K562細胞在不同濃度抗H作用下的細胞增殖抑制率。 6.用Trizol法提取不同濃度抗H作用于誘導(dǎo)后K562細胞的總RNA。 7.使用SYBR GREEN熒光定量PCR法檢測不同濃度抗H作用于誘導(dǎo)后K562細胞FUTl基因的相對表達量。 8.使用Annexin V/PI法檢測不同濃度抗H作用于誘導(dǎo)后K562細胞的凋亡 結(jié)果 1.不同濃度hemin誘導(dǎo)不同天數(shù)的K562細胞后K562細胞內(nèi)的血紅蛋白合成量不同,以50uM/L誘導(dǎo)K562細胞4d后細胞內(nèi)血紅蛋白合成量最高。 2.誘導(dǎo)后K562細胞表面血型抗原表達過弱,其ABO血型抗原用吸收放散試驗,微量淋巴細胞毒試驗等常規(guī)方法無法檢測到。采用基因測序方法確認K562細胞株ABO血型為0型。 3.MTT檢測K562細胞經(jīng)hemin誘導(dǎo)及不同濃度的抗H試劑作用后,1：8與1：16稀釋組組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)抗H稀釋度≤1：8時對細胞增殖有明顯的抑制作用。 4.熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示不同稀釋度抗H作用于誘導(dǎo)不同天數(shù)后的K562細胞,FUT1基因的表達量有明顯的變化,當(dāng)抗H稀釋度≤1：16時,對細胞FUT1基因的表達有明顯的抑制作用。 5.細胞凋亡檢測顯示,抗-H抗體可促使紅系定向分化后的K562細胞凋亡,隨加入的抗-H試劑稀釋度的增高,細胞凋亡率明顯降低,當(dāng)抗-H抗體1：16倍稀釋以上時,細胞凋亡率無明顯差異。 結(jié)論 1.不同濃度的Hemin誘導(dǎo)K562細胞向紅系定向分化的效果不同。 2.ABO血型抗體對經(jīng)誘導(dǎo)后向紅系定向分化的K562細胞的增殖有抑制作用。K562細胞在向紅系定向分化過程中代表紅細胞特異性的細胞內(nèi)血紅蛋白的合成量有明顯提高,但其細胞表面血型抗原的表達卻很弱。 3. K562細胞在向紅系定向分化過程中,表達H抗原的FUT1基因表達量有所增加,但一定濃度的抗H抗體可以抑制FUT1基因的表達。 4.在一定濃度范圍內(nèi),ABO血型抗體可通過細胞凋亡途徑抑制K562細胞向紅系定向分化成熟。細胞試驗證明ABO血型抗體可抑制干細胞紅系定向分化成熟,ABO血型抗體可能在PRCA的發(fā)生中起重要作用。 5.本研究建立的FUT1基因熒光定量檢測方法可檢測出基因表達量的變化,為研究紅細胞表面ABO血型基因表達建立了新方法。 6.本研究為臨床ABO血型不合異基因造血干細胞移植后PRCA發(fā)生機制提供了新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李雪英;李志平;王敏;施文潔;;孕婦IgG血型抗體與新生兒溶血病的關(guān)系[J];實用兒科臨床雜志;2011年17期

2 劉黎瓊;劉澤林;王欣;王淡瑜;崔海燕;金夢迪;;桂皮醛誘導(dǎo)K562細胞分化增強Mel18表達[J];河北醫(yī)藥;2011年14期

3 肖廣芬;姚晨姣;王成紅;唐雪元;;8-溴-7-甲氧基白楊素誘導(dǎo)K562細胞凋亡作用研究[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2011年03期

4 王海麗;魏武;紀(jì)愛芳;申徐良;張國香;張梅香;翟春燕;;馬錢子堿對人白血病細胞株K562細胞的誘導(dǎo)凋亡作用[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2011年03期

5 肖若芝;陳琰;王立琳;何程明;阮星星;熊慕s

本文編號：1555481