發(fā)布時間：2018-02-28 23:19

  本文關(guān)鍵詞： 剛地弓形蟲 MIC3 SAGI 疫苗 構(gòu)建 表達(dá)　出處：《山東大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會致病性蟲,呈世界性分布,可引起人獸共患弓形蟲病,由法國學(xué)者Nicolle及Manceaux于1908年發(fā)現(xiàn)。蟲體呈弓形,故命名為弓形蟲。其發(fā)育全過程一般包括5種不同形態(tài)的階段,分別是滋養(yǎng)體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊。其中滋養(yǎng)體、包囊、和卵囊與傳播和致病有關(guān)。人群感染雖多為隱性感染,但在免疫缺陷病人或孕婦,弓形蟲感染能導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥。有趣的是弓形蟲還能影響人的性情,有學(xué)者指出:與沒有感染弓形蟲的人相比,感染弓形蟲的人的智商要偏低,統(tǒng)計數(shù)據(jù)也表明弓形蟲與精神分裂癥有著某種聯(lián)系。家畜對弓形蟲易感,由弓形蟲感染引起的家畜的流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。貓、狗等寵物也易感染弓形蟲,是人類感染弓形蟲的重要傳染源。鑒于弓形蟲病對于人和家畜的破壞性作用所造成的經(jīng)濟(jì)損失,研制出具有免疫保護(hù)的疫苗迫在眉睫。 弓形蟲疫苗從死疫苗到減毒活疫苗,從直接提取蟲體的表面抗原到用基因工程技術(shù)提純單價亞單位疫苗,再到現(xiàn)在針對生活史不同階段、聯(lián)合多種抗原組合的復(fù)合多價疫苗。速殖子是弓形蟲主要的致病階段,其表膜是宿主免疫防御系統(tǒng)識別和殺傷蟲體的主要作用部位,膜抗原對于疫苗防治方面有著重要意義。弓形蟲表膜p30抗原是迄今為止弓形蟲抗原研究最多的一種抗原,其基因代號為SAG1,P30蛋白是一種期特異性蛋白,只存在于弓形蟲速殖子期,而在緩殖子期、子孢子期不表達(dá)。P30蛋白約占蟲體蛋白的3%～5%,但誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體可占抗體總量的50%。在急慢性病人血清中均能檢測出P30抗體。p30蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體都能限制人成纖維細(xì)胞的弓形蟲感染,說明抗體有相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用。P30抗原特異性的CD_4~+T細(xì)胞能直接殺傷細(xì)胞外弓形蟲,對弓形蟲感染的腹腔巨噬細(xì)胞亦有細(xì)胞毒性。弓形蟲對宿主細(xì)胞的粘附和入侵過程中伴隨著微線體內(nèi)容物的釋放,其中MIC3基因編碼的MIC3蛋白是弓形蟲微線體內(nèi)容物的一種,在弓形蟲入侵宿主過程中起到連接弓形蟲和宿主的橋梁的作用。MIC3是一種大小為90KD蛋白,參與蟲體與宿主細(xì)胞間的黏附過程,且在弓形蟲速殖子、緩殖子和子孢子三個感染階段都有表達(dá)。MIC3在早期能夠誘導(dǎo)小鼠和人分泌高效價的IgG抗體以及IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10等細(xì)胞因子,使機(jī)體產(chǎn)生高強(qiáng)度的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,作為疫苗候選分子具有巨大的潛力。 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表的弓形蟲SAG1及MIC3基因序列,在保證其開放讀碼框架正確的前提下,自行設(shè)計合成引物,在引物的5'末端分別加上適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切位點(diǎn),PCR擴(kuò)增得到SAG1及MIC3基因。鑒定基因片段后通過克隆技術(shù),構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-SAG1-MIC3、pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-MIC3。并對氨芐篩選的重組入外源基因的質(zhì)粒通過PCR、酶切和測序鑒定。采用脂質(zhì)體法將重組載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后Trizol提取細(xì)胞總RNA,以O(shè)ligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一條鏈。管家基因β-actin PCR驗(yàn)證逆轉(zhuǎn)錄,SAG1-MIC3、SAG1、MIC3基因片段PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。以驗(yàn)證真核表達(dá)載體pcDNA3.1能否在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄復(fù)合基因SAG1-MIC3及單基因SAG1、MIC3。 本實(shí)驗(yàn)顯示三個真核表達(dá)質(zhì)粒成功構(gòu)建,且載體攜帶的SAG1-MIC3融合基因、SAG1、MIC3單基因在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄生成mRNA。從而為今后的動物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ),為弓形蟲復(fù)合多價亞單位疫苗的研制提供了候選成份。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R382.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1549409