本文關(guān)鍵詞： 豬帶絳蟲 六鉤蚴 TSOL18 單克隆抗體 噬菌體展示技術(shù) 抗原表位 抗原定位　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：囊尾蚴病是由豬帶絳蟲的幼蟲——囊尾蚴寄生于人或豬而引起的人畜共患寄生蟲病,該病不僅給畜牧業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失,而且還威脅著人類健康,是經(jīng)濟(jì)落后國(guó)家和地區(qū)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。TSOL18是豬帶絳蟲六鉤蚴階段特異性表達(dá)的抗原,主要在六鉤蚴入侵中間宿主的早期階段分泌,其免疫血清在體外能有效殺死六鉤蚴,體外表達(dá)的重組TSOL18能完全保護(hù)豬不被豬帶絳蟲蟲卵感染。隨著免疫學(xué)的發(fā)展,人們認(rèn)識(shí)到有效的保護(hù)是抗原表位的參與。因此,闡明豬帶絳蟲TSOL18蛋白的抗原表位和組織分布對(duì)于該病的新型診斷試劑以及分子疫苗設(shè)計(jì)方面意義重大。 本研究挑取實(shí)驗(yàn)室保存的重組菌株P(guān)ichia pastoris pPIC9K-TSOL18進(jìn)行5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng),甲醇誘導(dǎo)72 h后將表達(dá)上清液進(jìn)行SDS-PAGE,用薄層掃描分析,目的蛋白約占上清總蛋白含量的80%以上,目的蛋白表達(dá)量達(dá)2.00g/L。重組蛋白TSOL18經(jīng)Sephadex G-100分子篩凝膠層析純化后,其純度達(dá)90%,滿足制備單抗的抗原要求。 將純化的TSOL18作為免疫原,制備了12株可分泌TSOL18單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,經(jīng)分型試紙條鑒定,12株單抗分屬于IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM抗體亞型,輕鏈均為K型；ELISA疊加試驗(yàn)表明,12株單抗分別識(shí)別2個(gè)不同抗原表位,2株不同抗原表位單克隆抗體的腹水效價(jià)分別達(dá)1×102和1×106；雜交瘤細(xì)胞株的染色體組型、單抗的穩(wěn)定性等的分析表明,所獲得的12株單抗均能穩(wěn)定分泌,滿足常規(guī)實(shí)驗(yàn)的要求。 采用次氯酸鈉溶液、膽汁和胰酶獲得激活的六鉤蚴,蟲卵的脫殼率為95%,六鉤蚴的活力為72%,然后用TSOL18免疫的豬血清和TSOL18單抗對(duì)激活的六鉤蚴分別進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn),臺(tái)盼藍(lán)染色判定六鉤蚴活力。結(jié)果證實(shí)在有補(bǔ)體的情況下,多抗和單抗6天時(shí)對(duì)六鉤蚴的殺傷率分別為73%和52%。 為了分析單抗的抗原結(jié)合位點(diǎn),本研究利用TSOL18單克隆抗體篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù),通過(guò)四輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的親和篩選,對(duì)噬菌體12肽庫(kù)進(jìn)行了富集。隨機(jī)挑取的59個(gè)噬斑提取DNA后測(cè)序,根據(jù)測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)出的TSOL18單抗識(shí)別的表位氨基酸序列分別為ETTKLQRFQAML (L1)和DHTLF (L2),兩個(gè)序列出現(xiàn)頻率分別是83%和15%。ELISA方法檢測(cè)噬菌體克隆與單抗MAb或BSA的結(jié)合反應(yīng)表明,兩個(gè)表位均與單抗特異性結(jié)合。在驗(yàn)證噬菌體蛋白抑制實(shí)驗(yàn)中,加入不同滴度的純化噬菌體Ll或L2克隆,以阻斷TSOL18 MAb與TSOL18抗原的結(jié)合,結(jié)果顯示,隨著噬菌體滴度的降低,對(duì)TSOL18 MAb與TSOL18抗原結(jié)合的抑制率也逐漸降低,呈劑量效應(yīng)關(guān)系。 將篩選出的特異性噬菌體克隆大量擴(kuò)增,純化蛋白免疫小鼠,檢測(cè)血清與TSOL18蛋白的反應(yīng)性。ELISA結(jié)果顯示,篩選的兩個(gè)表位均能與TSOL18抗原發(fā)生反應(yīng)。同時(shí)用兩個(gè)表位作抗原檢測(cè)表位與TSOL18免疫的豬血清的反應(yīng)性。ELISA結(jié)果顯示,兩個(gè)表位均與被檢血清反應(yīng)。用篩選到的表位檢測(cè)豬囊尾蚴病血清,ELISA敏感性分別為85%(L1)和79%(L2)。利用噬菌體展示技術(shù)篩選TSOL18抗原表位為豬囊尾蚴病免疫和診斷技術(shù)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 采用膠體金標(biāo)記技術(shù)對(duì)豬帶絳蟲六鉤蚴宿主保護(hù)性抗原TSOL18進(jìn)行定位,發(fā)現(xiàn)金顆粒沉積于小鉤、穿刺腺細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和分泌顆粒周圍,而對(duì)照血清的六鉤蚴膠體金染色未見(jiàn)特異性金顆粒沉積。
[Abstract]:Cysticercosis is parasitic larvae by cysticercus of Taenia solium in pigs or human caused zoonotic parasitic disease of the disease, not only cause economic losses to the livestock industry, but also a threat to human health, economy is behind.TSOL18 public health problems in countries and regions is important with pig antigen specificity the expression of the six stage larvae tapeworm, mainly secreted in the early stage of six ancylostome invasion of the intermediate host, the immune serum can effectively kill six larvae in vitro, the recombination TSOL18 can completely protect pigs by eggs of Taenia solium infection. With the development of immunology, people realize that effective protection is the antigen the epitope involved. Therefore, to clarify the Taenia solium epitope of the TSOL18 protein and tissue distribution of new diagnostic reagents for the disease and molecular vaccine design is significant.
This study was preserved in the laboratory of pastoris pPIC9K-TSOL18 recombinant strain Pichia 5L fermentor fermentation and methanol induction after 72 h expression supernatant SDS-PAGE analysis by TLC, the target protein accounted for more than 80% of the total protein content of the supernatant, the protein expression of 2.00g/L. recombinant protein TSOL18 by Sephadex G-100 gel chromatography later, the purity of 90%, meet the monoclonal antibody antigen.
The purified TSOL18 as immunogen, preparation of the 12 strains could secrete TSOL18 monoclonal antibody hybridoma cell line by typing test strip identification, 12 McAbs belong to IgG1, IgG2a, IgG2b, IgM antibody subtype, light chain were K type; ELISA stack test showed that the 12 mAbs were identified. 2 different epitopes, 2 strains of different epitopes of monoclonal antibody titers of ascites were 1 * 102 and 1 * 106; karyotype analysis of hybridoma cell lines, monoclonal antibody stability showed that the 12 mAbs could stably secrete, meet the general requirements of experiments.
Using sodium hypochlorite solution, bile and trypsin activation of six larvae, the egg shell rate was 95%, six ancylostome activity is 72%, then the pig serum immunized with TSOL18 and TSOL18 monoclonal antibody on activation of six larvae were carried out in vitro experiment, trypan blue staining was used to determine six ancylostome results confirmed the vitality. With the absence of complement, polyclonal antibody and monoclonal antibody 6 days killing rates of six larvae were 73% and 52%.
In order to analyze the antigen binding sites, this study used TSOL18 monoclonal antibody phage random peptide library of 12 through four rounds of "adsorption elution amplification" of affinity screening, 12 phage display peptide library was enriched. The 59 plaques were randomly selected from DNA sequenced according to the sequencing results of TSOL18 monoclonal antibody derived recognition the epitope of amino acid sequences were ETTKLQRFQAML (L1) and DHTLF (L2), two sequences are indicated with 83% frequency response and 15%.ELISA method to detect the phage clones with mAb MAb or BSA, two epitopes with single anti specifically. In the verification of phage protein inhibition experiments, purified phage Ll or L2 clone with different titer, results indicated the combined blockade of TSOL18 MAb and TSOL18 antigen, with the decrease of phage titer, inhibition of binding to TSOL18 MAb and TSOL18 antigen were also decreased, There is a dose effect relationship.
The specific phage clones were screened to amplify and immunize mice with the purified protein, and serum TSOL18 reactive protein.ELISA results showed that the screening of the two epitopes can react with TSOL18 antigen. At the same time with the two epitopes for reactive.ELISA results of porcine serum antigen detection and TSOL18 immune epitope show that the two epitopes were detected with serum response. The epitope detection of swine cysticercosis with serum screening, the sensitivity of ELISA was 85% (L1) and 79% (L2). Screening of TSOL18 antigen laid the foundation for a further study of immune and diagnostic techniques for cysticercosis by phage.
Using colloidal gold labeling technique of Taenia solium oncosphere six host protective antigen TSOL18 localization, particle deposition in cash around the puncture hooks, glandular cells of cytoplasm and secretory granules and six ancylostome colloidal gold staining serum specific gold particle deposition.

【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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