發(fā)布時(shí)間：2018-02-26 21:55

  本文關(guān)鍵詞： 神經(jīng)母細(xì)胞瘤 Notch-1信號(hào)通路 RNAi 慢病毒　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的: 構(gòu)建針對(duì)Notch-1基因的RNAi慢病毒表達(dá)載體,從轉(zhuǎn)錄后水平抑制Notch-1基因表達(dá),為研究Notch-1信號(hào)通路提供技術(shù)工具;并利用構(gòu)建的RNAi慢病毒感染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y,篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,觀察抑制Notch-1信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y增殖的影響。 方法: 設(shè)計(jì)合成兩對(duì)針對(duì)Notch-1 mRNA不同位點(diǎn)的shRNA編碼序列,克隆到慢病毒穿梭質(zhì)粒中,然后通過(guò)Gateway重組構(gòu)建重組RNAi慢病毒表達(dá)載體;在293FT細(xì)胞中包裝并進(jìn)行病毒滴度測(cè)定,獲得高滴度的病毒上清;慢病毒感染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y,RT-PCR和Western Blot檢測(cè)構(gòu)建的RNAi慢病毒對(duì)Notch-1表達(dá)的抑制效果;利用RNAi慢病毒抑制Notch-1表達(dá),探討Notch-1信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y增殖的影響。 結(jié)果: 1、成功構(gòu)建了針對(duì)Notch-1基因兩個(gè)不同位點(diǎn)的RNAi慢病毒表達(dá)載體,經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定干擾片段的堿基序列及插入位點(diǎn)完全正確; 2、在293FT細(xì)胞中包裝,獲得高滴度慢病毒上清;病毒液滴度在1.5×10~5TU -2.3×10~5TU之間,可滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要; 3、構(gòu)建的兩個(gè)RNAi慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞后可使Notch-1mRNA表達(dá)量分別下降80%和66%; 4、慢病毒感染SH-SY5Y后進(jìn)行MTT檢測(cè),RNAi慢病毒組與無(wú)義干擾組和對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖率明顯下降(p0.05或p0.01)。 結(jié)論: 構(gòu)建Notch-1特異的RNAi慢病毒表達(dá)載體能有效抑制Notch-1基因的表達(dá),可以作為研究Notch-1信號(hào)通路的重要技術(shù)手段;Notch-1信號(hào)通路被抑制后對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的增殖有重要影響。
[Abstract]:Objective:. The expression vector of RNAi lentivirus targeting Notch-1 gene was constructed to inhibit the expression of Notch-1 gene at post-transcriptional level, which provides a technical tool for the study of Notch-1 signaling pathway. Using the constructed RNAi lentivirus to infect the neuroblastoma cell line SH-SY5Y, a stable transfected cell line was screened, and the effect of inhibiting the Notch-1 signaling pathway on the SH-SY5Y proliferation of neuroblastoma cells was observed. Methods:. Two pairs of shRNA coding sequences targeting different sites of Notch-1 mRNA were designed and synthesized and cloned into lentivirus shuttle plasmids. Then recombinant RNAi lentivirus expression vector was constructed by Gateway recombination, and then packaged in 293FT cells and detected by virus titer. High titer virus supernatant was obtained, RNAi lentivirus constructed by RT-PCR and Western Blot was used to detect the inhibitory effect of RNAi lentivirus on Notch-1 expression, RNAi lentivirus was used to inhibit Notch-1 expression, SH-SY5YT RT-PCR and Western Blot were used to detect the inhibitory effect of lentivirus on Notch-1 expression. To investigate the effect of Notch-1 signaling pathway on SH-SY5Y proliferation of neuroblastoma cells. Results:. 1. The expression vector of RNAi lentivirus targeting two different sites of Notch-1 gene was successfully constructed. The base sequence and insertion site of the interfering fragment were identified by PCR and sequencing. (2) High titer lentivirus supernatant was obtained by packaging in 293FT cells, and the titer of the virus was between 1.5 脳 10 ~ (5) TU and 2.3 脳 10 ~ (5) TU, which could meet the needs of subsequent experiments. 3After the two RNAi lentiviruses were infected with SH-SY5Y cells, the expression of Notch-1mRNA decreased by 80% and 66, respectively. 4. After lentivirus was infected with SH-SY5Y, the cell proliferation rate of lentivirus group was significantly lower than that of unsense interference group and control group (P 0.05 or p 0.01). Conclusion:. The construction of Notch-1 specific RNAi lentivirus expression vector can effectively inhibit the expression of Notch-1 gene. It can be used as an important technical means to study the Notch-1 signaling pathway. The inhibition of Notch-1 signaling pathway has an important effect on the proliferation of SH-SY5Y in neuroblastoma cells.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1539826