本文關(guān)鍵詞： 骨髓細(xì)胞 干細(xì)胞 分化 肝干細(xì)胞 大鼠　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 研究背景:骨髓干細(xì)胞(Bone Marrow Stem Cells,BMSCs)是一種具有多向分化潛能及自我復(fù)制功能的早期未分化細(xì)胞,其易分離、純化和擴增,是細(xì)胞治療中的理想干細(xì)胞來源[1-3]。骨髓干細(xì)胞主要有造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)兩大類已經(jīng)被證實。近年隨著骨髓干細(xì)胞研究增多及深入,發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞不僅能分化成同胚層的細(xì)胞,而且能跨胚層分化為其他細(xì)胞。如在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下能分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨和骨骼肌細(xì)胞等多種組織細(xì)胞[4-10],進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),骨髓干細(xì)胞也可以分化為肝干細(xì)胞。目前認(rèn)為肝干細(xì)胞是體內(nèi)存在的一種具有自我增殖能力和多向分化潛能的干細(xì)胞。大量研究證實成體肝臟內(nèi)存在肝干細(xì)胞,卵圓細(xì)胞作為一種肝干細(xì)胞可分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞[11-12],它在肝損傷時積極參與肝組織的修復(fù)。目前關(guān)于骨髓干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的報道較多,但關(guān)于骨髓干細(xì)胞向肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的報道尚少,因此本實驗依此為切入點,在體外進(jìn)行骨髓干細(xì)胞向肝干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究。 肝臟疾病是臨床的常見病多發(fā)病,而傳統(tǒng)治療方法對終末期肝病的療效有限,原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)是公認(rèn)較有效的治療手段,但因供肝短缺,技術(shù)復(fù)雜而難以普遍應(yīng)用;生物人工肝、肝細(xì)胞移植治療與原位肝移植治療比較,具有操作簡單、可重復(fù)性強、一肝多用、供肝細(xì)胞免疫原性低且可凍存、移植失敗或產(chǎn)生免疫排斥后對受體影響小等優(yōu)點,此外,肝細(xì)胞在體外還可以進(jìn)行基因修飾,是一個良好的基因治療載體,故肝細(xì)胞移植被認(rèn)為是理想的治療方法。因肝細(xì)胞來源受限制,所以干細(xì)胞的研究為利用干細(xì)胞移植和/或干細(xì)胞工程生產(chǎn)肝細(xì)胞來治療各種肝病提供了可能性。 研究目的:①實驗?zāi)M肝臟發(fā)育的微環(huán)境,在體外誘導(dǎo)大鼠骨髓干細(xì)胞向肝干細(xì)胞分化;②探索在體外大鼠骨髓干細(xì)胞分化為肝干細(xì)胞的可行性及在誘導(dǎo)分化過程中的特征;③對誘導(dǎo)分化的肝干細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)和功能的鑒定;④為肝干細(xì)胞移植治療作實驗準(zhǔn)備。 實驗方法:無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨及脛骨,沖洗骨髓腔,獲取骨髓液,采用密度梯度分離法分離培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞,設(shè)誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組,應(yīng)用肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)25ng/mL、成纖維生長因子-4(Fibroblast Growth Factor-4,FGF-4)10ng/mL、干細(xì)胞生長因子(Stem Cell Factor,SCF)10ng/mL共同誘導(dǎo),于誘導(dǎo)的第0、7、14、21、28天,觀察細(xì)胞形態(tài)變化;采用放射免疫法檢測培養(yǎng)上清液中甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)濃度;免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測甲胎蛋白(AFP)、細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin19,CK19)、白蛋白(albumin,ALB)的表達(dá);PAS糖原染色法測定誘導(dǎo)細(xì)胞中糖原的表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)細(xì)胞中AFP、ALB陽性表達(dá)細(xì)胞比例。 結(jié)果:①誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓干細(xì)胞呈卵圓形或圓形的肝干細(xì)胞樣改變;②放射免疫法檢測到誘導(dǎo)組細(xì)胞甲胎蛋白濃度逐漸升高,第14d達(dá)高峰,隨后呈下降趨勢,與非誘導(dǎo)組相比,除第0,7d無差異,其余各時間點差異均顯著(P0.05);③免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測到誘導(dǎo)組細(xì)胞特異性表達(dá)甲胎蛋白、細(xì)胞角蛋白19及白蛋白;非誘導(dǎo)組基本不表達(dá)三種蛋白;④P AS糖原染色法檢測到在誘導(dǎo)21d和28d的細(xì)胞中糖原表達(dá)呈陽性;⑤流式細(xì)胞分析誘導(dǎo)組第14d甲胎蛋白陽性細(xì)胞比例為66.20%、誘導(dǎo)第28d白蛋白陽性細(xì)胞的比例為80.14%。 結(jié)論:①采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法能成功分離骨髓單個核細(xì)胞,且生長活力和純度均較好。②細(xì)胞種植密度在(5-10)×105個/cm2最有利于細(xì)胞生長;培養(yǎng)液中FBS濃度在10%-15%之間時,對骨髓干細(xì)胞增殖最有利。③HGF、FGF-4、SCF構(gòu)建聯(lián)合誘導(dǎo)體系,適合于誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向肝干細(xì)胞的分化,且三者相互協(xié)調(diào)作用于誘導(dǎo)分化的整個過程。④骨髓干細(xì)胞在體外能分化為肝干細(xì)胞樣細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞有分泌甲胎蛋白、細(xì)胞角蛋白19、白蛋白的特征性功能。⑤骨髓干細(xì)胞可以作為肝組織工程主要的種子細(xì)胞來源。骨髓干細(xì)胞易于獲得,操作方便,體外易于存活,使之成為組織工程學(xué)優(yōu)良的種子細(xì)胞。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329;R575

【引證文獻(xiàn)】

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1 謝杏榕;李云靜;李儒貴;雷飛飛;李金科;姚柏春;譚華炳;;胚胎肝細(xì)胞提取液體外誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化的實驗研究[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2013年01期

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本文編號：1534215