本文關(guān)鍵詞： 乙酰膽堿酯酶四聚體 乙酰膽堿 原子力顯微技術(shù) 磷脂膜 外周陰離子位點(diǎn) 囊泡融合　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:為探索乙酰膽堿酯酶(AChE)水解底物強(qiáng)大功能的可能機(jī)制,觀察底物及外周陰離子位點(diǎn)(PAS)抑制劑對(duì)重組在云母表面人工磷脂膜上的AChE四聚體(AChE G4)亞分子結(jié)構(gòu)的影響。內(nèi)容:重組于云母表面的人工磷脂膜的制備;AChE在人工磷脂膜上的重組;AChE多分子型的形態(tài)學(xué)研究;AChE G4和乙酰膽堿酯酶單體(AChE G1)的分離及純化;ACh及抑制劑對(duì)重組于云母表面人工磷脂膜上的AChE G4結(jié)構(gòu)的影響;重組于云母表面人工磷脂膜上的AChE G4結(jié)構(gòu)與底物抑制作用;丁酰膽堿(BCh)對(duì)重組于云母表面人工磷脂膜上的AChE G4結(jié)構(gòu)的影響。方法:冰浴超聲法制備磷脂膜;囊泡融合技術(shù)將AChE重組到以云母為支撐的磷脂膜上;透射電鏡(TEM)和原子力顯微技術(shù)(AFM)對(duì)比觀察AChE的多分子型;快速蛋白液相色譜法(FPLC)法對(duì)AChE G4和AChE G1進(jìn)行分離、純化;AFM觀察ACh或propidium (PAS抑制劑) -ACh等作用前后AChE G4的亞分子結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)改變,以及BCh對(duì)重組在人工磷脂膜上的AChE G4亞分子結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果:制備的以云母為支撐的人工磷脂膜均勻而平坦,融合后缺陷較少,測(cè)得形成磷脂膜的厚度是( 2.3±0.3 nm, n=30 ),這是單層磷脂膜的厚度。相同濃度的大豆卵磷脂成膜性不如蛋黃卵磷脂,膜中形成的缺陷較多,粗糙度明顯高于蛋黃卵磷脂形成的磷脂膜的粗糙度。在AFM的相位像中,磷脂膜的邊界呈高亮顯示,可看到與高度像上對(duì)應(yīng)的酶蛋白均勻地鑲嵌在磷脂膜上,酶蛋白比磷脂膜暗,表示酶蛋白的粘性比磷脂膜高,彈性比磷脂膜大。單個(gè)重組在以云母為支撐人工磷脂膜上的AChE G4(蛋白處于近生理?xiàng)l件下,非晶體狀態(tài))顆粒是邊界清晰、中間突出的橢圓形球體。構(gòu)成一個(gè)AChE G4顆粒的亞基之間排列緊密,未見(jiàn)亞基構(gòu)成,蛋白平均大小為[(89±7) nm×(68±9) nm×(6±3) nm,長(zhǎng)×寬×高,n=100]。單個(gè)重組在以云母為支撐人工磷脂膜上的AChE G1的大小為[(18±5)nm×(15±4)nm×(4.02±0.67)nm,長(zhǎng)×寬×高, n=100]。低劑量7μM S-ACh對(duì)重組在以云母為支撐人工磷脂膜上的AChE G4亞分子結(jié)構(gòu)最明顯的影響是亞基排列松散,粗糙度值明顯增大,亞基之間形成一個(gè)無(wú)阻礙空間,即在四聚體的中間形成一個(gè)中央通道,這與Χ-射線晶體學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果相一致,中央通道依次經(jīng)小→大→小→側(cè)門(mén)變化,單個(gè)AChE G4顆粒平均大小為[ (104±7) nm×(91±5) nm×(8±2) nm,長(zhǎng)×寬×高, n=100],無(wú)阻礙空間大小為[(60±5) nm×(51±9) nm,長(zhǎng)×寬,n=30],側(cè)門(mén)口寬(52±5)nm,縱深(32±3)nm,n=10;而在PAS抑制劑存在下,ACh不能引起AChE G4亞分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在50μM S- ACh作用下,AChE G4的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯不同于7μM S-ACh引起的酶結(jié)構(gòu)的變化,可看到形成了多個(gè)大小不一的環(huán)形蛋白結(jié)構(gòu),直徑為350～400nm,環(huán)形結(jié)構(gòu)彼此之間有連接;也有沒(méi)有發(fā)生明顯變化的蛋白,直徑在150～170nm,沒(méi)有發(fā)生變化的蛋白通常是孤立的。在125μM S-ACh的作用下,酶仍然均勻分布在磷脂膜上,但酶的大小發(fā)生了明顯的變化,平均大小為[(16±2)nm×(15±1)nm×(1±0.2)nm,長(zhǎng)×寬×高, n=100],酶的高度明顯降低。與7μM S-BCh反應(yīng)后,構(gòu)成AChE G4的四個(gè)亞基排列也會(huì)出現(xiàn)松散態(tài),酶的大小為[ (100±5) nm×(87±6) nm×(7±3) nm,長(zhǎng)×寬×高,n=100],亞基之間形成了一個(gè)無(wú)阻礙空間,空間的大小比S-ACh作用后的要小,為[(38±4)nm×(35±2)nm,長(zhǎng)×寬,n=30]。結(jié)論:利用AFM可觀察到磷脂膜的微觀形成過(guò)程為脂質(zhì)體囊泡吸附→脂質(zhì)體囊泡之間發(fā)生粘著→脂雙層之間形成接觸點(diǎn)→磷脂囊泡破裂→形成磷脂分子層→磷脂分子層間流動(dòng)進(jìn)行融合;通過(guò)AFM相位像中磷脂膜和蛋白的粘彈性差別信息以及高亮顯示的膜邊界可以證明囊泡融合法成功地將AChE組裝到了人工磷脂膜上。根據(jù)在低劑量7μM ACh作用下,AChE G4亞分子結(jié)構(gòu)的變化,我們提出了AChE實(shí)現(xiàn)其高效性的基本原理:AChE G4快速水解ACh的可能關(guān)鍵步驟為:①在正常狀態(tài)下,處于緊密態(tài)的AChE G4只有兩個(gè)PAS是相對(duì)暴露的,在ACh的進(jìn)攻下,AChE產(chǎn)生強(qiáng)的靜電場(chǎng)能吸引陽(yáng)離子底物ACh與暴露的PAS結(jié)合,②單個(gè)亞基ACG開(kāi)放,ACh進(jìn)入狹隙底部,③底物被水解,④導(dǎo)致亞基之間瞬間斥力增大,四聚體之間形成中央通道,同時(shí)亞基之間通過(guò)變構(gòu)使四個(gè)PAS均更加暴露,⑤與單個(gè)亞基活性位點(diǎn)結(jié)合的產(chǎn)物膽堿和乙酸可經(jīng)亞基“后門(mén)”處到達(dá)中央通道,⑥酶分子的“側(cè)門(mén)”開(kāi)放,酶分子緊縮,⑦產(chǎn)物離開(kāi)酶,⑧酶再恢復(fù)原態(tài)。底物ACh引起AChE G4亞分子結(jié)構(gòu)的變化與其水解底物的高效性是一致的,AFM從形態(tài)學(xué)上證明了在底物ACh作用下AChE G4分子中間形成中央通道可能控制著酶的周轉(zhuǎn)速度。ACh與PAS的相互作用控制著AChE G4中央通道的產(chǎn)生及單個(gè)亞基活性中心狹隙的開(kāi)放,PAS抑制劑可阻斷這種作用。在50μM ACh作用下, AChE為了達(dá)到快速水解底物的作用,形成的大的環(huán)形結(jié)構(gòu)可能是由2～3個(gè)AChE G4形成的開(kāi)放式通道,多個(gè)AChE G4間形成的開(kāi)放式通道是與其水解底物的高效性相一致的。在125μM ACh作用下, AChE G4會(huì)發(fā)生底物抑制現(xiàn)象,是由于AChE G4解聚,變成了酶單體,最終導(dǎo)致發(fā)生底物抑制現(xiàn)象的是AChE的單體結(jié)構(gòu)。AChE G4與7μM S-BCh作用后構(gòu)成酶的四個(gè)亞基排列也會(huì)出現(xiàn)松散態(tài),亞基之間形成了一個(gè)無(wú)阻礙空間,空間的大小比S-ACh作用后的要小,這可能是AChE水解BCh比水解ACh速度慢的原因之一。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

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