本文關(guān)鍵詞： 造血干細(xì)胞 造血祖細(xì)胞 體外擴(kuò)增 三維培養(yǎng) 藻酸鹽 腺病毒載體 p18ink4c CKI siRNA　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：臍血是臨床上良好的造血干祖細(xì)胞來源之一。然而,單份臍血所能提供的造血干祖細(xì)胞數(shù)量較少,限制了臍血移植的應(yīng)用范圍。為了滿足青少年和成人患者的需要,必須在移植前體外擴(kuò)增臍血的造血干祖細(xì)胞數(shù)量。目前常規(guī)的體外擴(kuò)增造血干祖細(xì)胞的實(shí)驗方法是將造血干祖細(xì)胞單個懸浮培養(yǎng),依賴于較高劑量多種細(xì)胞因子的聯(lián)合作用。在這樣的培養(yǎng)體系里擴(kuò)增后的細(xì)胞無法長期重建造血。因此,發(fā)展新的體外擴(kuò)增造血干祖細(xì)胞的方法是十分必要的。 第一部分,藻酸鹽三維培養(yǎng)系統(tǒng)體外擴(kuò)增人臍血造血干祖細(xì)胞造血干祖細(xì)胞在體內(nèi)生存于骨髓微環(huán)境中,造血細(xì)胞之間、造血細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用是維持干細(xì)胞自我更新能力的因素之一。三維培養(yǎng)體系旨在模擬骨髓微環(huán)境而設(shè)計。我們的實(shí)驗設(shè)計藻酸鹽三維培養(yǎng)體系,包裝臍血單個核細(xì)胞,培養(yǎng)于培養(yǎng)皿靜止系統(tǒng)和Synthecon RWV旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)中,與常規(guī)培養(yǎng)體系(二維系統(tǒng))相比較。結(jié)果顯示常規(guī)培養(yǎng)體系在低濃度細(xì)胞因子培養(yǎng)臍血單個核細(xì)胞,細(xì)胞總數(shù)下降,CD34+細(xì)胞明顯減少。而三維靜止培養(yǎng)體系在低濃度細(xì)胞因子培養(yǎng)條件下,細(xì)胞總數(shù)上升,CD34+細(xì)胞明顯增加。三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)體系則可在更低濃度細(xì)胞因子作用下得到相類似的結(jié)果。在三維培養(yǎng)體系擴(kuò)增的細(xì)胞其粒巨系克隆形成細(xì)胞亦明顯增多,移植NOD/SCID小鼠可在移植細(xì)胞總數(shù)少的情況下,在小鼠體內(nèi)更好植活,重建造血。 第二部分,下調(diào)細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子p18ink4c對臍血造血干祖細(xì)胞的作用細(xì)胞的增殖分化是受到細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控的。調(diào)控細(xì)胞周期的有三大類重要分了,細(xì)胞周期素,細(xì)胞周期素依賴激酶和細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子CKI。p18ink4c屬于CKI,它作用于細(xì)胞周期G1期早期,抑制cyclinD-CDK4/6復(fù)合物的活性,使細(xì)胞停留于GO期。p18ink4c-/-小鼠表現(xiàn)為普遍的組織增生和器官腫大,正常小鼠移植p18ink4c-/-小鼠骨髓細(xì)胞模型顯示出p18ink4c-/-造血干細(xì)胞自我更新能力增強(qiáng)。我們的實(shí)驗以p18ink4c為目標(biāo),確定下調(diào)p18ink4c(?)的最佳siRNA序列,將該序列克隆到真核細(xì)胞siRNA表達(dá)載體,并構(gòu)建包裝pl8ink4c-siRNA腺病毒載體。實(shí)驗分別采用合成siRNA、p18ink4c-siRNA質(zhì)粒和p18ink4c-siRNA腺病毒載體轉(zhuǎn)染人臍血純化CD34+細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)用siRNA技術(shù)可以下調(diào)人臍血CD34+細(xì)胞的p18ink4c表達(dá),擴(kuò)增細(xì)胞數(shù),降低CD34+的減少。但是轉(zhuǎn)染效率較低,難以滿足臨床的需要。 這兩部分實(shí)驗,分別通過改變擴(kuò)增臍血造血干祖細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境和下調(diào)臍血干祖細(xì)胞細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)控分子,達(dá)到或部分達(dá)到了擴(kuò)增臍血造血干祖細(xì)胞的目的。其中三維藻酸鹽培養(yǎng)系統(tǒng)對臍血干祖細(xì)胞的擴(kuò)增達(dá)到理想結(jié)果,國內(nèi)外迄今無相同報道。而目前對造血干祖細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)的轉(zhuǎn)染效率不高,限制了下調(diào)p18ink4c分子擴(kuò)增造血干祖細(xì)胞的效率,還有待于今后轉(zhuǎn)染技術(shù)的完善和突破。
[Abstract]:Umbilical cord blood progenitor cells is one of the sources of clinical good stem. However, umbilical blood can provide the hematopoietic stem progenitor cell number, limiting the scope of application of cord blood transplantation. In order to meet the needs of adolescent and adult patients, must be in before transplantation in vitro amplification of cord blood hematopoietic stem progenitor cells. The experimental methods at present the in vitro expansion of hematopoietic stem and progenitor cells is a single progenitor cell suspension culture of hematopoietic stem, joint action depends on the higher dose of cytokines in the culture system. The amplified cells cannot be long-term hematopoietic reconstruction. Because of this, the development of new methods in vitro expansion of hematopoietic stem and progenitor cells is very necessary.
The first part, the alginate three-dimensional culture system in vitro amplification of human umbilical cord blood hematopoietic stem and progenitor cells in the in vivo survival of hematopoietic stem and progenitor cells in the bone marrow microenvironment, hematopoietic cells, between hematopoietic cells and stromal cells, interaction between cells and the extracellular matrix is one of the factors of stem cell self-renewal. Three dimensional culture system to maintain design and Simulation of bone marrow microenvironment. Our experimental design of alginate three-dimensional culture system, packaging of cord blood mononuclear cells were cultured in Petri dish static system and Synthecon RWV rotary culture system, and the conventional training system (2D system). The results showed that compared with the conventional culture system culture of umbilical cord blood mononuclear cells on cytokines in low concentration the total number of cells decreased, CD34+ cells decreased significantly. The three-dimensional static culture system in cytokine culture conditions under low concentration, the total number of cells increased, CD34+ cells Cell culture system increased significantly. The 3-D rotation can get similar results in lower concentrations of cytokines. The granulocyte macrophage colony formation in three-dimensional culture system of cells was also significantly increased in transplanted NOD/SCID mice transplanted cells count less, better in vivo engraftment and hematopoietic reconstruction.
The second part, down-regulation of cyclin dependent kinase inhibitor p18INK4C on human umbilical cord blood hematopoietic stem progenitor cells proliferation and differentiation of cells is tightly regulated cell cycle regulation of cell cycle. There are three kinds of important points, cyclins, cyclin dependent kinase and cyclin dependent kinase inhibitor CKI.p18ink4c belong to CKI, its role in the early G1 phase of the cell cycle, inhibiting the activity of the cyclinD-CDK4/6 complex, the cells were arrested in GO phase of.P18ink4c-/- mice showed widespread hyperplasia and organomegaly, p18ink4c-/- hematopoietic stem cell self-renewal ability enhancement of normal mice p18ink4c-/- transplantation of bone marrow cells in mice model. Our experiments using p18INK4C as the target, to determine the down-regulation of p18INK4C (?) the optimal siRNA sequence, the sequence was cloned into the siRNA eukaryotic expression vector, and construct pl8ink4c-siR packaging NA adenovirus vector. Experiments were used to synthesize siRNA, p18ink4c-siRNA plasmid and p18ink4c-siRNA adenovirus transfection of human umbilical cord blood purified CD34+ cells. The results showed that the expression of human umbilical cord blood CD34+ cells can be reduced with the use of siRNA technology p18INK4C, amplified cell number decreased CD34+ decreased. But the transfection efficiency is low and difficult to meet the clinical needs.
The two part of the experiment, the culture environment respectively by changing the expansion of hematopoietic stem and progenitor cells and down-regulation of cord blood stem / progenitor cell cycle negative regulatory molecules, achieved or partially achieved the expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. The three-dimensional alginate culture system of umbilical cord blood stem cell amplification to achieve the desired results, both at home and abroad so far no the same report. At present on hematopoietic stem progenitor cell transfection efficiency of transgenic technology is not high, the efficiency is limited by the down-regulation of p18INK4C molecular amplification of hematopoietic stem and progenitor cells, and has yet to be perfect through transfection.

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王博;王舒楠;張偉國;陳金華;李雪;;人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外擴(kuò)增、鑒定和生物學(xué)活性[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2009年18期

2 張曦,王蘋,陳幸華,劉林,彭賢貴,孔佩艷,劉紅;TNF-α對人臍血基質(zhì)細(xì)胞體外擴(kuò)增作用的觀察[J];重慶醫(yī)學(xué);2003年10期

3 李文益,黃紹良,侯玲玉,杜宏微,梅少芬;人臍血紅系祖細(xì)胞體外培養(yǎng)觀察[J];中國輸血雜志;1996年02期

4 王隨照,郁知非,曾耀英;人臍血免疫造血干/祖細(xì)胞的定量研究[J];中華血液學(xué)雜志;1997年12期

5 張曦,王蘋,陳幸華,劉林,彭賢貴,孔佩艷,劉紅,王慶余;人臍血基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)的實(shí)驗研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2003年10期

6 張健;趙珍誼;陳陽;石虹;任林廣;夏風(fēng)琴;;抗原誘導(dǎo)的人臍血CTL細(xì)胞活性的實(shí)驗研究[J];中國實(shí)驗診斷學(xué);2008年07期

7 張銘忱;張鍵;;抗原誘導(dǎo)的人CTL細(xì)胞活性的實(shí)驗研究[J];吉林醫(yī)學(xué);2009年23期

8 徐新,曹容華,侯桂華;靈芝多糖對人臍血LAK細(xì)胞增殖活性的影響[J];中國腫瘤生物治療雜志;1995年04期

9 譚漢君;人臍血的生物特性及臨床應(yīng)用[J];臨床兒科雜志;1996年05期

10 柴文祥,易定華,劉金成,趙榮;人臍血CD133~+和CD133~-細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗研究[J];中國臨床康復(fù);2005年11期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張建華;田志剛;張彩;王郡甫;孫lm;;臍血造血細(xì)胞的體外擴(kuò)增及分化特性初探[A];山東免疫學(xué)會、山東微生物學(xué)會醫(yī)學(xué)微生物學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)學(xué)會微生物學(xué)和免疫學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)藥生物技術(shù)學(xué)會2001年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2001年

2 周敦華;黃紹良;張緒超;吳燕峰;包蓉;魏菁;;人臍血來源MSC對臍血造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增作用的研究[A];第九屆全國實(shí)驗血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2003年

3 葉欣;曲迅;劉愛華;孫玉蘭;張軍;楊憲勇;張彬彬;;人臍血、外周血樹突狀細(xì)胞的體外擴(kuò)增及抗腫瘤效應(yīng)的研究(Ⅰ)[A];山東免疫學(xué)會、山東微生物學(xué)會醫(yī)學(xué)微生物學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)學(xué)會微生物學(xué)和免疫學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)藥生物技術(shù)學(xué)會2001年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2001年

4 孔佩艷;羅成基;周燕虹;郭朝華;;基質(zhì)細(xì)胞對體外擴(kuò)增造血細(xì)胞造血重建活性的促進(jìn)作用[A];第九屆全國實(shí)驗血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2003年

5 張毅;李長東;江小霞;劉元林;張雙喜;吳英;唐佩弦;毛寧;;胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及對臍血CD_(34)~+細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用[A];第九屆全國實(shí)驗血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2003年

6 張曉艷;陸化;劉澎;吳漢新;錢思軒;徐衛(wèi);朱雨;段麗敏;李建勇;;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增及聯(lián)合造血干細(xì)胞移植治療血液病的研究[A];第11次中國實(shí)驗血液學(xué)會議論文匯編[C];2007年

7 王冬梅;楊莉;李梁;馮凱;白慈賢;裴雪濤;;成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)分化為骨和軟骨細(xì)胞的研究[A];中國生物工程學(xué)會第三次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2001年

8 侯玲玲;曹華;裴雪濤;;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和向神經(jīng)細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的研究[A];中國生物工程學(xué)會第三次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2001年

9 倪世良;孫自敏;翟志敏;汪健;任學(xué)雷;劉會蘭;王祖貽;;體外擴(kuò)增與新鮮臍血CD_(34)~+細(xì)胞混合移植對NOD/SCID小鼠造血重建功能的研究[A];第九屆全國實(shí)驗血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2003年

10 李明輝;田丁;劉聰艷;孫雪靜;蘇力;萬歲桂;徐娟;;臍血細(xì)胞體外擴(kuò)增與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[A];第三屆全國血液免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2003年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 馮競　吳晉娜 通訊員 熊學(xué)莉 吳劉佳;人臍血源造血基質(zhì)細(xì)胞可輔助重建造血功能[N];科技日報;2011年

2 劉道安;臍血干細(xì)胞研究三面出擊[N];健康報;2005年

3 本版編輯　章?lián)P培 檀英霞 張志欣 宮鋒;血源緊缺將成歷史[N];健康報;2007年

4 記者 王代同 通訊員 黃文靖;我發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植可促進(jìn)角膜修復(fù)[N];科技日報;2005年

5 羅剛 黃文婧;干細(xì)胞技術(shù)有望用于角膜重建[N];健康報;2005年

6 記者崔大濤;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能促進(jìn)角膜重建[N];中國醫(yī)藥報;2005年

7 本報記者　 應(yīng)洪舒;舉步跨越待有時[N];中國醫(yī)藥報;2005年

8 本報記者　 游雪晴 實(shí)習(xí)生 劉奕詩;宏觀看標(biāo)本,微觀看基因[N];科技日報;2006年

9 張中橋;AMCase基因突變體克隆成功[N];中國醫(yī)藥報;2006年

10 本報記者 陳青松 余曉艷;創(chuàng)業(yè)、創(chuàng)新、創(chuàng)環(huán)境[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 袁燕;體外擴(kuò)增人臍血造血干祖細(xì)胞方法初步研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

2 鄒菁;維持體外擴(kuò)增臍帶血干細(xì)胞干性：下調(diào)異常升高的ROS和p38MAPKα信號[D];華中科技大學(xué);2011年

3 孫浩平;人臍血源間充質(zhì)干細(xì)胞與其基質(zhì)細(xì)胞對體外造血調(diào)控作用的比較研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

4 羅毅;抑制體外擴(kuò)增小鼠造血干細(xì)胞衰老維持干性：下調(diào)異常激活的mTORC1信號[D];華中科技大學(xué);2011年

5 馮一梅;高表達(dá)SDF-1人臍血源基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)PECAM-1介導(dǎo)調(diào)控巨核細(xì)胞增殖遷移的機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

6 蔣濤;基于“腎主骨生髓”理論的補(bǔ)腎中藥聯(lián)合BMP-2誘導(dǎo)人臍血MSCs體外成骨分化的研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2012年

7 范華驊;體外擴(kuò)增的人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制小鼠骨髓移植急性移植物抗宿主病[D];華東師范大學(xué);2012年

8 檀英霞;紅細(xì)胞的物理化學(xué)修飾[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

9 童英;多藥耐藥基因轉(zhuǎn)導(dǎo)提高人造血祖細(xì)胞對化療藥物抗性的體外研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2000年

10 蘇平;BDNF基因修飾的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療帕金森病的實(shí)驗研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉琰;人臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增和移植于BALB/C小鼠的實(shí)驗研究[D];蘇州大學(xué);2002年

2 蘇麗萍;人臍血造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增和移植SCID小鼠的實(shí)驗研究[D];蘇州大學(xué);2001年

3 張曦;人臍血基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)及其體外擴(kuò)增的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2003年

4 葛劍云;體外擴(kuò)增過程中造血細(xì)胞生理狀態(tài)和遺傳穩(wěn)定性研究[D];華東理工大學(xué);2011年

5 周小波;人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)與擴(kuò)增的實(shí)驗研究[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2010年

6 李金海;酸性成纖維細(xì)胞生長因子對人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞影響的實(shí)驗研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

7 尚曦瑩;RI基因在人臍血干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染和表達(dá)[D];大連醫(yī)科大學(xué);2003年

8 唐宇宏;體外擴(kuò)增臍血CD34～+細(xì)胞HOXB4基因表達(dá)的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2005年

9 袁杰;骨髓源性肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增后自體移植的臨床應(yīng)用研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

10 張蕾;低溫對人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響[D];河南大學(xué);2010年

，

本文編號：1520802